NSK三肽对日本脑炎病毒抑制活性的研究

【摘要】日本脑炎(Janpaneseencephalitis,JE)又称流行性日本脑炎(简称乙脑)是由日本脑炎病毒引起的一种严重危害人畜健康的中枢神经系统疾病。日本脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属,与西尼罗病毒、登革热病毒同属。该病不但影响畜牧业尤其是养猪业的发展,而且对人类的健康造成了极大的危害。随着分子生物学技术的发展,具有广谱的抗菌、抗病毒等多种生物活性作用的抗病毒肽逐渐成为开发这类药物的极具潜力的药品之一。病毒在活细胞内的增殖可分为五个环节,即吸附、穿入、脱壳、生物合成、成熟组装与释放。阻断病毒感染过程任一环节的药物均可成为抗病毒药物。E蛋白是乙脑病毒的囊膜蛋白和成熟病毒粒子表面的结构蛋白,可与细胞膜受体相结合从而与细胞膜融合促使病毒进入细胞的主要蛋白,研究表明其与病毒的吸附和入胞有关。抗病毒肽的作用机理一就是与细胞膜表面的一些受体结合从而达到抗病毒的作用。EDIIIloop3抗病毒肽就是通过阻断病毒体表面位点与细胞表面的受体结合达到抗病毒作用。本研究在EDIIIloop3抗病毒肽基础上进行筛选得到抗日本脑炎病毒的三肽。研究的主要内容如下：一、实验室通过对EDIIIloop3抗病毒肽第363-369位氨基酸通过点突变的方法进行改造,测序正确,将质粒转化Rosetta2大肠杆菌表达蛋白,亲合层析和分子筛纯化蛋白,通过WesternBlot检测,结果表明纯化得到目的蛋白。二、BHK-21细胞的培养,JEV扩增,TCID50测定病毒滴度。通过LDH法测定纯化的蛋白对于细胞的最大毒性浓度,蚀斑方法检测突变后EDIIIloop3蛋白对日本脑炎病毒的抑制效果。结果表明N、S、K三个氨基酸在EDIII抗日本脑炎病毒中其重要作用。三、利用不同浓度的NSK三肽作用BHK-21细胞后,进行接种日本脑炎病毒,利用蚀斑试验、实时荧光定量PCR和Westernblot检测,证明NSK三肽对日本脑炎病毒的抑制效果显著,实验表明NSK三肽在浓度为1000M抑制效果极为显著,并具有剂量依赖性和序列依赖性。四、通过对小鼠脑部注射抗病毒肽和腹腔注射抗病毒肽,然后攻日本脑炎病毒,对小鼠的精神状态及死亡数量进行记录和分析。结果表明,脑部注射抗病毒肽对日本脑炎的预防试验中小鼠的保护率高,第5天保护率达到90%,第7天保护率维持到70%,第21天保护率仍维持在70%。以上实验表明筛选得到的抗病毒NSK三肽具有较好的抑制日本脑炎病毒感染的效果。
【作者】于亚玲；
【导师】茅翔；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】日本脑炎病毒；NSK三肽；蛋白表达和纯化；体内(外)试验；

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