兔6种艾美耳球虫线粒体基因组序列测定及系统发生研究

【摘要】兔球虫病是由艾美耳科的艾美耳属（Eimeria）和等孢球虫属（Isospora）球虫寄生于兔的肠道或肝脏而引起的一种原虫病。目前国际上公认的兔艾美耳球虫有11种，等孢球虫1种，临床上通常为多种球虫混合感染，给兔养殖业带来严重的经济损失。目前对于兔球虫的研究主要集中在传统寄生虫学方面，关于兔球虫线粒体基因组测序及进化方面的研究还未见报道。本研究的第一部分内容是兔球虫卵囊的鉴定与纯种培养。通过形态学和特异性PCR方法鉴定球虫种类，在显微镜下挑取同种卵囊，接种球虫阴性家兔，通过培养获得纯种兔艾美耳球虫卵囊。本研究共获得兔艾美耳球虫纯种卵囊6种，分别为肠型艾美耳球虫（Eimeriaintestinalis）、黄色艾美耳球虫（E.flavescens）、中型艾美耳球虫（E.media）、维氏艾美耳球虫（E.vejdovskyi）、大型艾美耳球虫（E.magna）和无余艾美耳球虫（E.irresidua）。本研究的第二部分内容是获得兔6种球虫线粒体基因组序列，探讨6种球虫的分类地位。首先设计艾美耳球虫线粒体cytb基因的保守引物，扩增兔6种艾美耳球虫cytb基因部分序列。根据获得cytb基因已知序列，设计长PCR引物用来扩增6种兔球虫线粒体基因组全序列。经过长PCR扩增、测序、拼接等步骤，获得艾美耳球虫线粒体基因组全序列，然后分析6种艾美耳球虫线粒体全基因组的基因结构、核苷酸组成、密码子使用情况等信息，以线粒体全基因组蛋白质编码基因为标记，构建进化树，探讨兔艾美耳球虫在顶复门寄生虫中的进化位置。肠型艾美耳球虫、黄色艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和无余艾美耳球虫线粒体全基因组序列长度分别为6261bp、6258bp、6168bp、6254bp、6249bp、6259bp。6种艾美耳球虫的线粒体基因组组成相似，包括3个蛋白质基因，即细胞色素b（cytb）和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅲ（cox1、cox3），19个rRNA基因，即12个大亚基rRNA（L-rRNA）和7个小亚基rRNA（S-rRNA），无tRNA基因。6种球虫的碱基组成相似，偏好A、T。3个蛋白质基因的起始密码子不同，cytb、cox1、cox3基因分别使用ATG、GTT、ATT作为起始密码子，但无余艾美耳球虫的cox3起始密码子为ACT；所有6种兔艾美耳球虫均使用TAA作终止密码子。6种兔球虫线粒体全基因序列之间的差异为1.2%-7.1%，与鸡艾美耳球虫的差异为9.7%-15.6%。采用最大简约法（MaximumParsimonymethods，MP）、邻接法（neighbor-joiningmethod，NJ）和贝叶斯（Bayesiananalysis，Bayes）方法，构建进化树显示，球虫目、血孢子虫目和梨形虫目各为一独立分支；在球虫目这一分支中，6种兔球虫聚集在一起，关系最近，与鸡球虫的进化关系较近，与梨形虫目亲缘关系最远。本研究首次获得了兔6种艾美耳球虫线粒体基因组序列，丰富了原虫线粒体全基因组资料，为进一步研究兔球虫的群体遗传学、分子分类学和系统发生学奠定了基础。
【作者】田思勤；
【导师】朱兴全；王春仁；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】兔；艾美耳球虫；线粒体全基因组；序列分析；系统发生；

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