比格犬ERβ剪切异构体蛋白定位及其RNAi慢病毒载体的构建及筛选

【摘要】比格犬广泛应用于国家二类以上新药研发，但比格犬在繁殖方面出现了不发情、发情不孕、休情期长、窝产仔数减少等现象，为了探讨该犬繁殖性能降低的机理，本研究对ERβ剪切异构体的蛋白定位及其生物学功能进行研究。通过构建ERβ剪切异构体重组真核表达载体，瞬时转染HEK293T细胞，检测目的蛋白在体外细胞表达及定位情况；建立稳定表达ERβ剪切异构体细胞系；构建针对目的基因慢病毒介导RNA干涉表达载体，利用荧光定量PCR方法和WesternBlot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测对目的基因干涉效果。结果表明：成功构建比格犬ERβ剪切异构体MYC标签重组真核表达载体，WB结果显示，ERβ1293编码430aa，蛋白量大小为48kDa；ERβ1257编码419aa，蛋白量大小为47kDa；体外细胞蛋白定位结果表明，ERβ1293主要定位于细胞质，而ERβ1257均主要定位于细胞核；成功构建稳定表达ERβ1293和ERβ1257细胞株，WB结果表明目的基因得到高效的表达；分别针对两条ERβ剪切异构mRNA，各构建三条shRNA序列及一条shNC，并合成于慢病毒载体。qRT-PCR方法从mRNA水平检测干涉效果与WB方法从蛋白水平上检测结果相一致：ERβ1293-shRNA1（p<0.01）和ERβ1293-shRNA3（p<0.01）差异极显著，ERβ1257-shRNA1（p<0.01）、ERβ1257-shRNA3（p<0.01）差异极显著，ERβ1293-shRNA3和ERβ1257-shRNA3的干涉效果最优。实验结论：比格犬ERβ1293和ERβ1257MYC标签重组真核表达载体体外细胞转染蛋白量检测分别为48kDa和47kDa；蛋白定位分别定位于细胞质和细胞核；成功筛选出两条目的基因的有效shRNA序列，进而更深入地探索比格犬ERβ1293和ERβ1257的生物学功能。
【作者】甘艺；
【导师】杨焕民；胡仲明；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】雌激素β受体剪切异构体；RNA干涉；慢病毒；蛋白定位；

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