喹噁啉类对肾上腺皮质醛固酮分泌细胞基因和蛋白质表达影响研究

【摘要】喹噁啉类药物是一类人工合成的、含有喹嗯啉-1,4-二氧化物基本结构的一类化学合成抗菌药物,在提高饲料转化率、促进动物生长方面具有相当好的活性。随着该类药物的广泛使用,卡巴氧和喹乙醇已经被发现有明显的致癌、致畸、致突变、光敏和肾上腺皮质损伤等副作用。肾上腺是该类化合物主要的毒性靶器官之一,该类中大多数药物对肾上腺皮质产生损害,引起球状带分泌的醛固酮减少,造成动物机体内水盐代谢紊乱。为了阐述喹噁啉类药物对肾上腺产生毒性,及其下调醛固酮激素分泌水平,造成水盐代谢紊乱的机制,本课题以人肾上腺皮质癌细胞NCI-H295R细胞系为细胞模型,应用基因芯片,并采用蛋白质组学中经典的双向电泳和质谱分析相结合的技术为手段展开研究。本研究首先测定了喹嗯啉类药物喹烯酮和乙酰甲喹孵育H295R细胞12、24及36h时的细胞活力,结果显示,两种药物对H295R细胞的毒性均呈现出剂量依赖性和时间依赖性趋势,并且初步确定喹烯酮的细胞毒性大于乙酰甲喹的。然后在保证细胞活力的基础上,调整药物浓度,采用醛固酮ELISA检测试剂盒检测药物对H295R细胞分泌醛固酮激素的影响,结果显示,喹烯酮下调醛固酮激素分泌的能力也强于乙酰甲喹的。当QCT孵育细胞12h,各个药物浓度作用下,醛固酮激素分泌水平均没有发生显著变化；当15μMQCT孵育细胞24h后,醛固酮激素的分泌量显著性下降(75.85%±1.09%)(p<0.05),20μMQCT孵育细胞24h后,醛固酮激素分泌量极显著性下降(44.00%±6.98%)(p<0.01)。所以,后续实验采用喹烯酮作为受试药物,并且确定药物作用时间为24h,作用剂量为一个低剂量10μM和一个高剂量20μM。10和20μMQCT孵育H295R细胞,同时设置空白对照,药物与细胞作用24h后,采用Agilent公司生产的人表达谱芯片筛选两个药物剂量下H295R细胞中差异表达的基因。结果显示,10μM喹烯酮处理组与空白组相比有349个差异表达基因,其中上调基因有210个(名称和功能已知的基因有150个),下调基因有139个(已知基因有98个)；20gM喹烯酮处理组与空白组相比有4583个差异表达基因,上调的有2835个(名称和功能已知的基因有1931个),下调的有1748个(已知基因有1095个)。将这些差异基因按生物学进程分为6类：与细胞内物质和能量合成代谢相关、与转运相关、与细胞应激相关、与信号转导相关、与细胞发育过程相关及与转录调控相关。分析相关基因功能,与无机离子、氨基酸、神经递质、糖类、嘌呤和脂肪酸等物质转运相关的基因的表达量发生改变,提示喹烯酮干扰了细胞内正常的生命活动。参与类固醇激素合成和代谢的基因表达量也发生了改变,特别是与胆固醇合成相关的一些基因的表达量均上调,而负责将胆固醇外排出细胞的脂质转运体也发生上调表达；同时,胆固醇合成原料乙酰辅酶A提供者-脂肪酸在一种高度上调表达的SREBF1的作用下合成甘油三酯的进程加剧,三者协同作用影响醛固酮合成原料-胆固醇的浓度；控制类固醇激素合成方向的基因CYP17A1表达量上调,导致醛固酮合成受阻；另外调控CYP11B2转录的一种重要转录因子NR4A2的表达量下调,抑制其转录；同时与氧化应激相关的一些基因表达量下调,提示QCT可能通过抑制Nrf2/Keap1/ARE通路的下游基因NQO1、HMOX1、G6PD和SRXN1等的表达,加剧药物造成的氧化应激现象,进而造成ROS的大量蓄积,引起肾上腺皮质细胞毒性。挑选6个基因,采用qRT-PCR技术验证基因芯片结果,挑选的6个基因的变化趋势与芯片结果基本保持一致；并选择Keap1运用Westernblot技术研究其蛋白表达情况,结果该蛋白表达量的变化趋势与芯片结果基本一致。所以基因芯片结果的可靠性得到了保证。运用双向凝胶电泳技术和飞行时间质谱分析技术发现,与空白组细胞相比,喹烯酮处理H295R细胞24h后,共鉴定出41种差异蛋白质,分为8类：包括物质合成及能量代谢相关蛋白、转录、翻译和蛋白质加工相关蛋白、信号转导蛋白、细胞骨架类蛋白、分子伴侣、应激蛋白、转运蛋白及其他。其中多个物质和能量代谢中比较重要的酶类,如与ATP合成相关的二烯酰基辅酶A异构酶、醛脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、6-磷酸葡萄糖内酯酶及核苷二磷酸激酶A等表达水平发生改变。结合基因芯片结果,推断喹烯酮干扰了H295R细胞内正常的物质和能量合成代谢过程；喹烯酮通过下调葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的表达,干扰醛固酮合成过程中羟化酶所需NADPH的供应,影响醛固酮的生物合成通路。此外,其他蛋白质,如消除代谢过程中产生的过氧化物的过氧化物酶-2的表达量的下调,与物质转运相关的蛋白如脂肪酸结合蛋白及与凋亡相关的蛋白如程序性细胞死亡蛋白5的下调,在喹烯酮对H295R细胞发挥毒性作用时发挥协同效应。挑选TCP1和NME1采用Westernblot技术验证双向电泳和质谱分析结果,两者结果保持一致。综上所述,本研究首次运用基因组和蛋白质组技术,探讨了喹噁啉类药物对动物机体的肾上腺产生毒性作用的机制及引发醛固酮激素合成和分泌紊乱的机理,我们发现ABCG1、SREBF1等与调控胆固醇浓度的相关基因及CYP17A1、NR4A2、G6PD等与醛固酮合成相关基因是喹烯酮下调醛固酮合成和分泌的重要分子靶点。QCT可能通过PKC和ERK1/2通路上调CYP17A1的mRNA表达,抑制醛固酮的合成。而且喹烯酮引起的氧化应激很可能通过JNK(?)(?)p38-MAPK通路,引起细胞凋亡。同时,细胞内物质和能量合成代谢紊乱,是喹噁啉类药物引起肾上腺毒性的另一个重要因素。
【作者】白毅洁；
【导师】袁宗辉；
【作者基本信息】华中农业大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】喹烯酮；H295R细胞；胆固醇；醛固酮；物质和能量合成代谢；

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