半夏蛋白纯化、表达及其活性研究

【摘要】半夏(Pinelliaternata(Thunb.)Breit)为天南星科半夏属植物，以块茎入药，是一种传统中药，主要成分有蛋白、多糖、生物碱和有机酸等。半夏块茎有燥湿化痰、散结、降逆止呕等功效。研究表明半夏块茎具有抗早孕、抗肿瘤、抗虫、抗病毒、抗真菌、抗心律失常、促有丝分裂、降血脂和凝血等作用。半夏蛋白主要由半夏胰蛋白酶抑制剂和半夏凝集素组成。植物蛋白酶抑制剂和凝集素具备多种生物学功能活性，目前商业应用已经很广泛。本研究设计单步Trypsin-Sepharose4B亲和柱层析法来亲和分离纯化半夏胰蛋白酶抑制剂(Pinelliaternatatryspininhibitor，PTTI)。通过半夏块茎组织匀浆、水提、硫酸铵梯度沉淀和Trypsin-Sepharose4B亲和柱吸附及洗脱，得到一种新的蛋白酶抑制剂。SDS-PAGE显示纯化的半夏蛋白酶抑制的分子量为20kDa左右，应属于植物Kunitz型植物蛋白酶抑制剂。利用猪胰脏胰蛋白酶作为反应酶，BAPNA作为酶反应底物，得到纯化的半夏蛋白酶抑制剂的抑制比活力为366.5±14.57U/mg，纯化倍数为8.6倍。硫酸-苯酚法测得该蛋白的多糖含量为12.84±0.64%，表明从半夏块茎中的分离得到的半夏抑制剂蛋白是一种糖蛋白。稳定性实验表明该抑制剂对温度和pH都相对稳定。半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin，PTA)是一种单子叶甘露糖结合型植物凝集素，是四个亚基组成的同源二聚体。本研究利用Mannose-Sepharose4B亲和柱建立一种新的植物凝集素分离方法，通过优化亲和分离条件，高通量纯化得到半夏凝集素PTA。通过半夏块茎组织匀浆、浸泡过夜、硫酸铵沉淀和离心，得到半夏总蛋白。半夏总蛋白分别溶于10%，15%，20%，25%和30%不同质量分数的NaCl溶液中处理，随后不同浓度NaCl溶液中的蛋白样品上样到Mannose-Sepharose4B亲和柱中用以吸附PTA，淋洗掉未结合的杂蛋白后，将PBS通入Mannose-Sepharose4B亲和柱中，发现可通过降低亲和柱中缓冲液的盐离子浓度从而将亲和吸附的PTA洗脱下来。含量测定表明当半夏总蛋白用25%NaCl溶液处理后可获得最大的纯化得率，为35.5mg/g半夏块茎。SDS-PAGE显示该方法分离得到的PTA分子量为12kDa左右且纯度很高，约97%。凝血实验表明PTA浓度为6μg/mL时可以明显凝集小鼠血细胞。本研究建立一种新的植物凝集素单步分离方法，不仅可用于甘露糖凝集素的分离，也可用于其他植物凝集素的分离。该方法与传统的植物凝集素分离方法相比，比如离子柱层析、凝胶过滤和猪甲状腺球蛋白亲和层析法，具有纯化得率高、产物纯度高、操作过程简单、经济花费少和产物无污染等特点，具有良好的工业应用前景。信号肽APSP可引导目的肽链穿过细胞内膜进入内膜与外膜的周质空间内，然后该信号肽序列被信号肽裂解酶特异性切除，获得末端保真性肽链，在一系列生化酶的作用下，重组肽链可形成二硫键并且正确折叠。本研究通过PTA的结构信息，以pta基因为模板，设计特异PCR引物，克隆得到编码半夏凝集素N端结构域肽链基因pta-n。根据大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽核酸序列apsp，设计PCR引物，通过三步PCR法，将apsp核酸序列融合到pta-n的5’端，获得融合目的基因apsp-pta-n，以期实现PTA-N的分泌性表达。该目的基因经过限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，产物片段与表达质粒酶连，构建得到重组表达质粒pET-28a-apsp-pta-n并转入到表达菌株E.coliBL21(DE3)获得工程菌株。该工程菌株经过IPTG诱导表达、超声波破碎与离心，获得细胞破碎上清液。Ni-NTA亲和柱用于重组蛋白PTA-N的纯化，SDS-PAGE用于证实目的蛋白的诱导表达与纯化结果。SDS-PAGE表明该目的蛋白可以可溶性表达并被Ni-NTA亲和柱纯化，纯化得率约为20mg/L。凝血与抑制实验表明PTA-N(6μg/mL)能凝结小鼠血细胞。抗真菌实验显示PTA-N对小麦赤霉菌Gibberellasaubinetii具有生长抑制作用。抗肿瘤实验MTT法表明PTA-N对多种肿瘤细胞系有生长抑制作用，进一步的Hochest33342核染色和DNA片段化分析表明PTA-N处理人类肝癌肿瘤细胞Bel-7404后可形成凋亡典型的凋亡小体和梯状化核酸片段。这些结果证明PTA-N通过诱导Bel-7404发生凋亡而发挥抗肿瘤活性，这些结果也表明重组表达的PTA-N具有与天然PTA相似的生理功能。本研究根据PTA晶体结构信息，通过碱性磷酸酶信号肽与目的蛋白融合，构建分泌表达体系，实现半夏甘露糖结合凝集素在原核表达系统中的可溶性表达，为其他植物凝集素的表达提供一定参考。
【作者】周炜；
【导师】徐涛；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】半夏胰蛋白酶抑制剂；半夏凝集素；纯化；分泌表达；抗肿瘤；

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