基于基因组重测序比较早实枳与普通枳遗传差异

【摘要】早实枳为普通枳的早花变异。为研究早实枳起源及其与普通枳之间的遗传关系,本实验室前期曾采用过多种分子标记分析,也逐一克隆了主要成花调控基因的DNA序列,如FT、SOC1、FLC、TFL、PtmiR172、PtmiR156等,均未能发现早实枳与普通枳之间的区别。在柑橘属克里曼丁橘和甜橙全基因组测序数据发布后,本实验室对早实枳和普通枳进行了基因组重测序,以期发掘早实枳与普通枳的关键差异基因,为研究二者成花习性差异的分子机理寻找突破口。本研究通过生物信息学方法对基因组重测序结果中的InDel进行标记,按其插入缺失长短及是否造成移码进行了分级,试图筛选二者间关键的差异基因。采用RT-PCR验证差异基因后,构建超表达载体转化模式植物拟南芥验证差异基因的功能。主要研究结果如下：1.以克里曼丁橘为参考基因组,采用生物信息学方法分析了早实枳和普通枳基因组重测序数据,发现二者与克里曼丁橘参考基因组之间存在较多的SNP与InDel差异,但与作为对照的克里曼丁橘×普通枳杂种相比,早实枳与普通枳中的SNP与InDel纯合位点百分率较高,暗示早实枳的起源可能是普通枳的珠心胚变异导致,而非异种间杂交产生。2.分析InDel的分布情况,对大量InDel变异进行初筛,发现早实枳的CDS(Codingsequence)区域存在818个特异性InDel.采用PCR扩增、逸传转化、测序等方法验证28个早实枳和克里曼丁橘的InDel,共获得了10个(35.7%)InDel；而普通枳和克里曼丁橘的36个InDel中则有12个(30.0%)。表明重测序能够发现待测材料之间的遗传差异,但如果待测材料与参考基因组存在较大遗传差异时,检测分析到的变异位点存在一定误差。3.对早实枳CDS区的818条特异片段进行筛选分类,依据其基因功能是否与成花相关、插入/缺失片段长短、插入/缺失片段长度是否为3的倍数,将其由重要性由低到高分别设定为1-5级。4.对重要性判定为4和5的128条InDel进行验证,筛选得到6个在早实枳与普通枳的CDS区域含有InDel的差异基因,检测号分别为：Pt-Cc-009(ATSRG1)、Pt-Cc-034(NAD(P)-linked)、Pt-Cc-040(N2-dimethylguanosinetRNAmethyltransferase)、Pt-Cc-059(AGO5)、Pt-Cc-061(无注释)和Pt-Cc-062(zincfingerCCCH-typefamilyprotein)5.对Pt-Cc-061基因(UN基因)进行Realtime-PCR分析,发现其在早实枳的根、早实枳和普通枳的花中表达量较高。此外分别构建了早实枳和普通枳的UN基因的超表达载体,转化模式植物烟草和拟南芥,分别获得烟草转基因愈伤组织,和转基因拟南芥T1代种子。
【作者】李文洋；
【导师】胡春根；
【作者基本信息】华中农业大学，果树学，2014，硕士
【关键词】枳；全基因组重测序；InDel；PCR；遗传转化；

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