羊附红细胞体病流行病学调查及猪附红细胞体粘附作用研究

【摘要】附红细胞体附着于猪、羊等动物的红细胞表面,会引起患病动物溶血性贫血、黄疸、发热以及生殖系统紊乱等症状。该病原在我国多省份流行,具体的入侵机理尚不清楚,常呈潜伏感染和混合感染状态。目前已报道的诊断方法中尚无特异性诊断羊附红细胞体病的方法,在临床上常因不能及时发现该病原的存在,从而导致羊的继发感染或死亡。本研究首先建立了半巢氏PCR诊断方法,并对湖北省羊附红细胞体病的流行情况做了初步的调查。另外本实验还探讨了猪红细胞膜蛋白Band3、GlycophorinsA(GPA)与猪附红细胞体粘附相关蛋白GAPDH、OSGEP的相互作用,从蛋白质水平探究了附红细胞体的致病机理。1、羊附红细胞体半巢氏PCR诊断方法的建立根据GenBank中羊附红细胞体16SrRNA基因序列(EU165509.1),设计引物并建立半巢式PCR方法。新建立的方法敏感性高达10-10fg,特异性试验分析表明与猪附红细胞体、牛温氏附红细胞体、绵羊肺炎支原体、瑟氏泰勒虫以及东方巴贝斯虫均无交叉反应。2、湖北省羊附红细胞体病流行情况调查从湖北省七个不同地区共采集371份羊血液样本,用建立的半巢式PCR和报道的通用PCR(Neimarketal2004)检测羊附红细胞体。半巢氏PCR检测出151(41%)份阳性,而通用PCR仅检出97(26%)份阳性。通过比对长江南北的样品以及不同性别的样品并经SPSS20.0分析发现,羊附红细胞体病在湖北省各地区均存在,长江以北地区的感染率(47%)高于长江以南地区(31%)且差异显著(P<0.05),而性别差异不显著(P>0.05)。本研究证实半巢式PCR比通用PCR更敏感,更适合于检测羊附红细胞体以及流行病学调查。3、红细胞膜蛋白与附红细胞体相关粘附蛋白互作蛋白的筛选利用膜蛋白提取方法从血液中提取了天然的红细胞膜蛋白,并以此为模板进行Far-westernblotting(FarWB)实验,实验中首先用BCA试剂盒测定带HIS标签的GAPDH、OSGEP蛋白浓度,将浓度统一稀释为5μg/mL后与天然红细胞膜蛋白孵育过夜,结果表明GAPDH、OSGEP可与多种红细胞膜蛋白作用,其中Band3、GPA两种蛋白作用最为明显。4、猪红细胞膜蛋白Band3、GPA基因的克隆与原核表达根据猪红细胞膜蛋白Band3、GPA基因序列设计两对特异性引物,从15日龄的小猪脾脏和骨髓中提取RNA,并从反转录得到的cDNA中扩增得到目的片段,构建克隆质粒后测序鉴定,测序结果显示Band3、GPA片段大小分别为1077bp和495bp,构建GST标签原核表达质粒pGEX-6P-1-Band3、pGEX-6P-1-GPA,在E.coliBL21中的表达产物经Westernblot(WB)检测分析,结果显示两种蛋白均高效表达。对目的片段的最佳表达条件的摸索,结果显示BL21/pGEX-6P-1-Band3、BL21/pGEX-6P-1-GPA最佳诱导条件为37℃5h,ITPG最佳诱导浓度是分别为0.8mmol/L、0.6mmol/L。5、红细胞膜蛋白与附红细胞体相关粘附蛋白互作蛋白的验证在最佳条件下表达Band3、GPA重组蛋白用于His-tagpull-down实验,最后洗脱液经WB分析均为Bait与Prey两种蛋白条带,结果表明Band3/GPA可以分别和GAPDH/OSGEP相互作用。本研究一方面建立了针对羊附红细胞体病的敏感、特异的semi-nestedPCR,并对湖北省该病流行情况作了初步的调查与分析。另一方面,证明红细胞膜蛋白Band3、GPA可分别与GAPDH和OSGEP两个蛋白相互作用。这些研究为深入探讨Band3/GPA在附红细胞体入侵红细胞中的作用奠定了基础,为阐明附红细胞体的感染机制提供一定的理论依据。
【作者】宋韦娇；
【导师】赵俊龙；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】附红细胞体；半巢氏PCR；流行病学调查；Band3；GPA；Farwesternblotting；Pull-downassay；

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