DNA甲基化在氡致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用

【摘要】目的：通过体外染氡，诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化，建立氡致肺癌的细胞模型,通过检测细胞恶性转化过程中甲基化转移酶基因mRNA表达以及相关抑癌基因甲基化水平的改变，探索氡致肺癌的机制，为氡致肺癌的防治提供理论依据。方法：将处于对数生长期的BEAS-2B细胞以1.5×105个接种于Transwell培养皿中，细胞贴壁后将Transwell培养皿置于染毒腔内，氡气持续泵入直接与细胞接触染毒,每次同时染毒3个Transwell培养皿，氧气浓度恒定于21%，水浴维持染毒腔温度恒定于37℃。CCK-8法检测不同染氡浓度和时间后细胞存活率，确定合适的染氡浓度和时间后进行正式染毒。染氡两次后将Transwell培养皿中的细胞消化下置于培养瓶中常规培养，待生长至对数生长期后进行下一代染氡，氡染毒两次算作染氡一代，共染氡30代。对照组暴露于氡浓度为空气本底值的相同装置中，其余条件同染氡组。完成30代染氡且各染氡代细胞分别传代至40代后，分析各代的细胞周期、凋亡和线粒体膜电位变化；软琼脂克隆形成实验，染氡30代且传代至40代细胞裸鼠成瘤实验检测细胞恶性转化情况，荧光定量PCR检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA表达情况。甲基化特异性PCR检测Rn20-40、Rn30-40和对照组细胞MGMT、ERCC1、XRCC1、RARβ及LINE-1甲基化水平，并检测MGMT、RARβ基因mRNA表达情况。结果：（1）细胞染氡模型的建立。在染氡时间相同条件下，随染氡浓度升高，细胞存活率逐渐下降；在氡浓度相同条件下，随染氡时间延长，细胞存活率逐渐降低，最后确定染氡浓度和时间为20000Bq/m3，30min。BEAS-2B细胞在氡持续染毒10代并传代至20代已出现形态学改变，细胞呈现异形性，呈复层重叠生长,随染氡及传代代数的增加，细胞形态学及生长趋于稳定，表现出类似癌细胞的生长特性。细胞周期显示G1期明显缩短，S期明显延长，细胞传代后凋亡率均比染氡初期明显降低，染氡后细胞线粒体膜电位降低，表明细胞处于增殖旺盛状态，其周期发生一定程度的失控，同时细胞凋亡率明显降低，呈现凋亡抑制状态。（2）细胞恶性程度改变：与对照组相比，染氡10代细胞软琼脂克隆形成能力已明显增强，染氡30代传代至40代的细胞软琼脂克隆形成率已达到27.27±1.10％（P<0.05）；裸鼠成瘤实验表明染氡30代且传代40代的BEAS-2B细胞已具有体外裸鼠成瘤能力，与对照组细胞相比，Rn30-40细胞体外种植裸鼠成瘤率达到30％（P<0.05）。分离肿块做病理分析可见瘤细胞大小不一，呈弥漫性分布，为低分化癌，对照组裸鼠肿块病理分析未见异型性明显的肿瘤细胞。DNMT3A基因在各染氡代细胞传至40代时表达均明显升高。除Rn1-20，Rn10-20外，其余各染氡代细胞DNMT1基因表达明显降低。（3）甲基化状态改变：对MGMT、ERCC1、XRCC1、RARβ及LINE-1甲基化状态进行检测，发现MGMT和RARβ基因在染氡组细胞中均发生了DNA甲基化修饰，而ERCC1和XRCC1基因在染氡组细胞中均未发生DNA甲基化修饰，LINE-1基因在对照组细胞中呈现高甲基化状态，而在Rn30-40组细胞中呈现低甲基化状态。对MGMT和RARβ基因mRNA表达情况进行检测，与对照组相比，染氡组细胞mRNA表达均降低，差异有统计学意义。（P<0.05）。结论：1.建立并确认了体外染氡诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型，且细胞恶性程度随染氡代数和传代代数的增加呈现剂量效应关系，细胞出现移植成瘤。2.细胞恶性转化过程中，DNA甲基化转移酶基因表达发生了改变，同时出现MGMT，RARβ基因高甲基化，LINE-1基因低甲基化，这些可能是氡染毒致BEAS-2B细胞恶性转化的机制。
【作者】韦晔；
【导师】李建祥；
【作者基本信息】苏州大学，卫生毒理学，2014，硕士
【关键词】氡；肺癌；DNA甲基化；细胞恶性转化；基因表达；

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