缺氧调控奶牛子宫内膜上皮细胞表达BoLA-A和MIC1的研究

【摘要】奶牛繁殖障碍是影响奶牛生产性能与经济效益的重要原因。在奶牛妊娠过程中,母体对胎儿的识别依赖于母胎界面组织相容性复合物(BoLA-I)的表达,这不仅影响着胚胎的正常着床,也影响着胎盘组织中相应免疫细胞的聚集、细胞因子的分泌,对维持妊娠和动物分娩都具有十分重要的调节作用。由于胎盘血管重塑及生长需要一定时间,因此胚胎在早期附植期间均处于缺氧环境中；随着滋养层细胞不断的侵袭,胎盘血管网逐渐建立起来,保证了胚胎的供氧,营养物质以及代谢产物在母体与胎儿之间进行正常交换。缺氧诱导因子(HIF)在缺氧状态下对血管形成的相关因子具有特异性的调节作用。HIF通过调节大量靶基因的表达,继而调节滋养层细胞侵润,血管重塑以及母体与胎儿血氧平衡过程。大量研究发现HIF-1α的表达是细胞缺氧的特异性标示物,而二氯化钴(CoCl2)可以作为一种诱导剂与HIF-1α中的氧依赖降解区(ODD)结合来诱发细胞缺氧,从而建立体外培养细胞缺氧模型。本试验首先利用CoCl2作用于体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞(EEC),建立了浓度-时间CoCh缺氧模型；采用荧光定量PCR检测不同缺氧状态下BoLA-A与MIC1的表达；将实验室已制得的兔抗牛BOLA-A与MIC1多克隆抗体作为一抗,采用WesternBlotting检测蛋白的表达。通过研究缺氧调节BoLA-A与MIC1的表达作用进而为研究妊娠调节的机理及分子通路提供科学依据。1.CoCl2缺氧模型的建立根据文献报道中CoC12干预的浓度与时间设置,设定的二氯化钴浓度为4×4浓度-时间(400μmol/L,200μmol/L,100μmol/L,50μmol/L；24h,12h,6h,3h)预实验模型,通过检测细胞的凋亡率来控制COC12对细胞的毒性作用,应用荧光定量PCR检测HIF-1A的mRNA表达均明显升高,最终确定3×3浓度一时间(400μmol/L200μmol/L,μmol/L；12h,6h,3h)干预模型,至此成功建立CoC12缺氧模型。2.荧光定量PCR检测BoLA-A与MIC1的mRNA表达情况在此浓度时间CoCl2形成的缺氧环境下,BoLA-A基因整体表达呈现明显上调趋势,且随着时间和浓度增加,上调幅度显著增大。在二氯化钴作用12h,6h,3h后,不同浓度组的BoLA-AmRNA的表达量都明显高于对照组,且差异极显著(P<0.01),且浓度越高表达量越高,400μmol/L二氯化钴作用12h时,BOLA-A基因的表达量是空白组的8倍(P<0.01)。在CoCl2作用3h时,400μmol/L和200μmol/L两组的MIC1表达量与空白组相比受到极显著抑制(P<0.01),空白组的MIC1表达量是这两组的5倍,而100μmol/L组相对空白组几乎没有差异；在二氯化钴作用6h后,高浓度组(400μmol/L,200μmol/L)对MIC1表达抑制作用显著减小(P<0.01),而低浓度组(100μmol/L)却出现了显著的抑制作用(P<0.01)；在CoCl2作用12h后,高浓度组(400μmol/L200μmol/L)中MIC1表达量与空白组并无太大差异,而低浓度组(100μmol/L)则出现显著的抑制作用(P<0.01)。3.WesternBlot检测BOLA-A与MIC1的蛋白表达情况COCl2形成的细胞缺氧环境对BOLA-A蛋白的表达有一定的促进作用。在高浓度组(400μmol/L),BoLA-A蛋白表达量相对空白组显著增加,在作用12h时,表达量逐渐增加且显著高于空白对照组(P<0.05)。在较高浓度组(200μmol/L),3h后BoLA-A的蛋白表达量相对空白对照组并无太大变化,但随着时间增加到6h,表达量出现明显增加。在低浓度组(10μmol/L),BOLA-A的表达量始终低于空白对照组的表达,然而随着时间的增加,其表达量却又缓慢增加。CoCl2形成的细胞缺氧环境对MIC1蛋白的表达起到抑制作用。在高浓度组(400μmo1/L),MIC1的表达量显著低于空白对照组(3h,P<0.01),CoCl2对其蛋白表达表现出显著抑制作用,而随着时间的增加其表达量逐渐增加,在12h时,MIC1的表达量高于空白对照组,表现出一定的促进作用。在较高浓度组(200μmol/L),MIC1的蛋白表达量均低于对照组,但是随着时间的增加,抑制作用减少,在12h时其蛋白表达量与空白组相同,几乎没有抑制作用。在低浓度组(100μmol/L),MICl的表达量均低于对照组,且随着时间增加,表达量下降,抑制作用加强。结论：本实验成功建立了CoCl2诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞体外缺氧模型；缺氧上调了BOLA-A基因和蛋白的表达,而抑制MIC1基因和蛋白的表达。
【作者】李彬彬；
【导师】邓干臻；
【作者基本信息】华中农业大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】缺氧；BOLA-A；MIC1；二氯化钴；子宫内膜上皮细胞；奶牛；

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