湖北省不同地区柔嫩艾美耳球虫的抗药性调查

【摘要】鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属的原虫寄生于鸡肠道细胞,从而引起的以肠炎、腹泻带血、饲料转化率下降甚至死亡为主要特征的寄生虫病。鸡球虫病在世界各地都有分布和流行,造成了巨大的经济损失,阻碍了养禽业的发展(Williams2002;DalluoulandLillehoj2005).迄今为止,使用化学药物治疗是生产中防治鸡球虫病的主要手段,但随着抗球虫药越来越频繁的使用,球虫对药物的抗药性问题也随之浮现。由于球虫疫苗的研制存在很多关键问题尚未解决(Sharmanetal2010),因此在未来相当长的时间里,使用抗球虫药仍是防治球虫病的主要手段(ChapmanandShirley2002)。抗药性是鸡球虫病防治中最为严重的问题,也是亟待解决的难题。在本研究中,从湖北省8个地区的23个养鸡场采集新鲜粪便,通过鸡体扩大增殖实验分离得到20个柔嫩艾美耳球虫野外分离株；利用PCR和RT-PCR分别扩增不同虫株的球虫抗药性可能相关基因MIC2,SAG,cation-transportingATPase和Cytb,测序分析了不同虫株之间基因的序列差异；通过笼养实验,检测了不同基因型和地理分布的虫株对马杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度,分析相关抗药基因的突变与抗药性产生的关系。(1)不同地区E.tenella分离株的获得采集了湖北省黄冈、黄石、荆州、随州、天门、武汉、襄阳、咸宁8个地区23个鸡场的新鲜粪便,球虫卵囊镜检结果显示有20个样本检出球虫卵囊,感染率为87.0%。检出的卵囊孢子化后在鸡体内进行扩大增殖,根据柔嫩艾美耳球虫寄生位置的特异性,收集盲肠中的柔嫩艾美耳球虫卵囊。鸡体增殖实验得到20个柔嫩艾美耳球虫野外分离株。(2)相关抗药基因的扩增及测序通过PCR和RT-PCR,扩增得到MIC2,SAG,cation-transportingATPase和Cytb基因,序列测定结果表明：MIC2基因无碱基突变；SAG基因虫株之间无突变,但与Genebank报道的序列存在一个碱基差异,此突变为同义突变；根据堆型艾美耳球虫阳离子转运ATPase基因保守序列设计相关PCR引物,在柔嫩艾美耳球虫中扩增得到约500bp产物,测序并进行同源性比对。同源性比对发现此段序列与其他艾美耳球虫有很高的相似性,表明扩增得到的此段序列为柔嫩艾美耳球虫阳离子转运ATPase基因的一部分,序列比对表明此段序列在不同分离虫株间无突变；Cytb基因测序发现第22位点,第49位点和第838位点存在差异,且均为错义突变,分别导致Cytb氨基酸序列第8位点(Qisite)、第17位点和第280位点的氨基酸变异。(3)不同E.tenella分离株对三种抗球虫药的敏感程度根据基因型和地理分布,把20个虫株分为9类,通过笼养实验检测对马杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度。结果表明野外分离虫株对马杜拉霉素都表现严重的抗药性,虫株间无明显差异；野外分离虫株对地克珠利敏感,虫株间差异不大；癸氧喹啉的抗药性则表现明显的虫株地区差异与基因型的差异：湖北东部虫株敏感,其他地方虫株抗药；未突变株敏感,突变株则表现明显的抗药性。(4)相关抗药性基因的突变与抗药性产生的关系通过分析MIC2、SAG、cation-transportingATPase和Cytb基因的序列与相关抗药性的关系,得出结论：本研究中无法证实球虫对地克珠利抗药性产生机制与MIC2&SAG的基因突变有关；球虫对马杜拉霉素的抗药性与ATPase基因的突变无关；Cytb第22位碱基的突变可能是导致球虫癸氧喹啉抗药性产生的原因。本研究调查了湖北省不同地区柔嫩艾美耳球虫对不同抗球虫药物的耐药情况,同时从柔嫩艾美耳球虫基因水平来揭示和阐述了抗药性产生的机制,为进一步了解球虫抗药性的产生机理、新的抗球虫药物的开发以及建立球虫抗药性的快速检测方法提供了基础。
【作者】李亚林；
【导师】赵俊龙；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】鸡球虫病；柔嫩艾美耳球虫；抗药机制；抗药相关基因；基因突变；抗药性实验；

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