调节NMD通路中SMG5的miR-433的鉴定及miRNA-NMD-作用底物调控通路的初步研究

【摘要】在真核细胞的进化过程中形成许多mRNA质量监控机制来实现基因的准确表达,其中无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是一种重要的转录后监控机制,可识别含提前终止密码子(prematureterminationcodons,PTC)的异常mRNA并对其进行降解,有效避免产生的截短蛋白对细胞的毒害。其中,SMG5在NMD中扮演着重要的角色,SMG5是一个编码蛋白基因,没有核糖核酸酶活性,但对逆转录酶的活性有促进作用,它和SMG7一起被认为与涉及核酸外切途径的mRNA降解机制存在联系—通过招募磷酸酯酶2A(PP2A)引起UPF1的脱磷酸化。microRNA(miRNA)是一类长度约为19-24nt内源性保守单链非编码小分子RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3’UTR特异互补结合,在转录后水平上调节靶mRNA的表达或者阻止蛋白的翻译,目前研究表明,miRNA参与了许多生理及病理的过程,例如,参与了肿瘤的发生发展和转移、细胞凋亡、细胞增殖和分化的生物化学过程等。但是目前有关miRNA参与NMD通路的报道比较少,因此,作用于NMD通路中的主要因子的miRNAs是不是介导mRNA的降解是一个值得研究的课题,本试验以NMD通路中的关键因子SMG5为研究对象,通过生物信息学的方法筛选出潜在的以SMG5为靶基因的miR-433。并利用分子生物学方法研究二者的作用关系,以及在NMD通路中所发挥的作用。主要的研究结果如下：(1)生物信息学预测潜在调控SMG5的miRNAs。利用生物信息学软件TargetScan等对作用于SMG53’UTR的miRNA进行预测,结果得到了多个miRNAs,经过筛选最终确定miR-433作为研究对象。(2)组织表达谱的构建。利用实时定量PCR技术检测miR-433和SMG5在小鼠心、肝、肾等十二种组织的表达量,并绘制了组织表达谱。结果显示：SMG5基因在小鼠组织中广泛表达,miR-433在脑和肌肉中表达量较高。(3)双荧光素酶报告基因的检测。根据miR-433与SMG5基因的3’UTR结合序列,构建了野生型和突变型荧光素酶报告基因pmirGLO载体。并将这两种质粒分别与miR-433mimic和miR-433inhibitor共转入HEK-293T细胞、Hela细胞,检测相应的荧光活性,结果表明：miR-433与SMG5之间存在负调控的关系。(4)miR-433调控SMG5的表达检测。miR-433mimic转染BHK细胞后,利用RT-PCR和Westernblot检测SMG5的表达量,结果发现：SMG5的mRNA表达量显著下降(P<O.01),miR-433也降低了SMG5蛋白水平；而将miR-433inhibitor转染C2C12细胞后,得到的结果刚好相反,SMG5的表达量显著上升(P<O.01),miR-433inhibitor上调了SMG5的蛋白水平。(5)利用荧光定量PCR和westernbolt检测miR-433调控SMG5底物基因GADD45B.TBL2的表达。将miR-433mimic转染细胞后,利用荧光定量PCR和westernbolt检测NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表达,结果显示：miR-433上调了TBL2、GADD45B的表达,进一步推断miR-433参与NMD通路。(6)干扰SMG5对底物基因的影响。利用SMG5基因的siRNA,转染C2C12细胞,实时荧光定量PCR检测SMG5被干扰后底物基因TBL2、GADD45B的表达量,结果显示：干扰24h后,SMG5表达量较对照组显著下降(P<0.01),而TBL2、GADD45B则有不同程度的上升(P>0.05)；进行Westernbolt试验,所得的结果与此相符。从以上结果,我们推断miR-433能够通过抑制SMG5的表达参与NMD通路。
【作者】张芳；
【导师】任竹青；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】无义介导的mRNA降解；SMG5；miRNA-433；GADD45B；TBL2；

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