类受体激酶基因StLRPK1在本氏烟中的晚疫病抗性功能鉴定及其介导的可能信号途径分析

【摘要】马铃薯是继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。目前,全世界马铃薯生产面临的最大问题是由致病疫霉菌(Phytophthorainfestans(Mont.)DeBary.)引起的晚疫病,严重时导致作物绝收。植物抵抗病害的先天免疫系统主要由病原相关分子模式(PAMPs)激发的PTI和效应蛋白激发的ETI两个免疫反应组成。PTI是植物抵御病原微生物的重要机制,具有广谱持久的特点。前期研究中实验室在马铃薯中克隆到一个类受体激酶基因StLRPK1,初步研究显示StLRPK1可能作为模式识别受体在晚疫病持久抗性中起着重要的作用。本研究旨在通过在模式植物本氏烟草草中异源超量表达StLRPK1,进一步研究StLRPK1在晚疫病抗性中的作用,探讨StLRPK1介导的抗病信号传导途径,以期为利用PTI途径关键基因培育广谱、持久的马铃薯抗病新品种提供新思路和新方法。主要结果如下：1、为利用农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟草中高效表达外源蛋白,为将来开展StLRPK1蛋白活体免疫共沉淀研究打下基础,构建了pCB302-3-GFP的双元表达载体。通过优化表达条件,包括通过检测荧光蛋白GFP的表达发现：共同注射基因沉默抑制子p19、调整农杆菌菌液浓度OD600为0.8-1.0之间、农杆菌侵染3-5天时,GFP在本氏烟草中表现很强的荧光,表明以pCB302-3为载体,通过优化条件可以实现外源蛋白在本氏烟草草中高效表达。2、获得了超量表达StLRPK1的本氏烟草稳定转基因株系。晚疫病原菌接种鉴定表明：超量表达StLRPK1后,转基因株系对晚疫病抗性明显增强；组织化学染色显示：超量表达株系接种点周围活性氧和胼胝质累积增强；转基因株系中的两个PTI信号途径重要Marker基因Pti5和Acre31的表达量比对照明显增高。进一步证明StLRPK1在晚疫病抗性中具有重要作用3、为了探索晚疫病菌分泌的效应子(Effectors)对StLRPK1介导的PTI的抑制作用,利用在转基因本氏烟草叶片上瞬时表达效应子,再在注射点附近接种晚疫病原菌的方法,从18个效应子中筛选出了4个能够显著抑制StLRPK1介导抗性的效应子,为深入开展这些效因子如何调控StLRPK1介导的PTI奠定了基础。4、探索了StLRPK1可能参与的防卫信号传递途径。转基因株系中WRKY8下游基因NADP-ME和HMGR2的表达量与对照相比明显增强。但VIGS沉默转基因本氏烟草中与MAPK信号途径有关的MKK3、MPK2、MPK1、MPK3基因后,沉默株系中WRKY8及其下游基因NADP-ME和HMGR2的相对表达量总体上变化趋势不明显。结果表明StLRPK1介导的PTI与MAPK信号途径相关,但还需进一步严格验证。5、在细菌中成功表达、纯化了StLRPK1的激酶结构域；与γ-32P-ATP哺育后没有检测到特异的放射性产物,表明StLRPK1激酶域可能没有自激活性。黄色荧光互补实验初步证明StLRPK1与PTI信号传导关键组份BAK1蛋白可能互作,为深入研究StLRPK1介导PTI信号识别与传递奠定了基础。
【作者】孙春莲；
【导师】田振东；
【作者基本信息】华中农业大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】马铃薯；晚疫病；StLRPK1；抗病信号途径；PTI；

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