太平洋牡蛎类FUT2基因的克隆与时空表达

【摘要】诺如病毒（Norovirus，NoV）是人类急性病毒性肠胃炎的主要病原体，常引起严重的公共卫生与食品安全事件。研究表明NoV依靠识别组织血型抗原（histo-bloodgroupantigens，HBGAs）上的寡糖感染人体。太平洋牡蛎作为NoV感染人体的重要载体之一，体内存在的类A型组织血型抗原（A-likeHBGA）能够特异性富集NoV，并且富集NoV的含量存在季节性变化趋势，这种季节性变化趋势是否由类A型HBGA含量变化引起，类A型HBGA的合成关键基因是否影响其含量变化，目前尚未见报道。本研究以太平洋牡蛎类A型HBGA合成途径中的关键酶α-1,2-岩藻糖基转移酶（类FUT2）为研究对象，开展了类FUT2基因克隆与时空表达的研究，以期在分子水平上揭示太平洋牡蛎季节性富集NoV的机理。本研究通过同源克隆的方法获得太平洋牡蛎类FUT2基因的cDNA序列（GenBank登录号KJ184342）。研究结果表明，太平洋牡蛎类FUT2基因cDNA全长为1941bp，包含180bp的5非翻译区、编码361个氨基酸的1086bp的开放阅读框以及675bp的3非翻译区。分子进化聚类分析结果显示，太平洋牡蛎类FUT2基因与家鼠（Musmusculus）等哺乳动物的FUT2基因聚为1个分支。对太平洋牡蛎类FUT2基因密码子优化后，构建重组原核表达载体pRSET-mof，转化大肠杆菌BL21，经终浓度为1.0mmol/LIPTG在37℃诱导4h后表达产生目的蛋白，SDS-PAGE检测分析目的蛋白的表达状况，并通过6×His-Tag标签的单克隆抗体和人类FUT2的单克隆抗体分别进行westernblotting检测。结果显示，类FUT2基因在大肠杆菌表达系统中成功获得表达，表达产生的蛋白大小约为48kD（a目的蛋白约为42kDa，6×His-Tag约为6kDa），与类FUT2理论值（41.62kDa）相符；并且可以与抗人类FUT2的单克隆抗体结合。针对太平洋牡蛎类FUT2基因序列设计实时荧光定量RT-PCR引物，采用SYBRGreen染料法，以β-actin为内参基因，基于Delta-DeltaCT相对定量法，建立类FUT2基因的实时荧光定量RT-PCR检测方法，开展类FUT2基因表达量的分析，对该基因在牡蛎不同组织、不同季节的时空表达特点进行研究。结果表明，在牡蛎肝胰脏、闭壳肌、外套膜、唇瓣和鳃5个组织中均能检测到类FUT2基因mRNA的存在，且唇瓣中的表达量最低，其余4个组织中的表达量无显著差异（P<0.01）；6月份牡蛎各组织的类FUT2基因的表达量均较低，在2~3月份呈下降趋势，在6~12月份呈现先增高后降低的趋势，但在7~11月份的含量普遍都偏高。通过牡蛎类A型HBGA的ELISA检测，发现类A型HBGA的含量在8月至次年5月的含量普遍较高，其中在1~3月份其含量呈现下降趋势，3~5月份呈现上升趋势，6~11月份总体处于上升趋势，而8~11月份均具有较高的含量。证实牡蛎类FUT2基因mRNA的分布规律与牡蛎类A型HBGA含量的季节性分布趋势存在一定相关性。本研究为探索牡蛎特异性富集NoV的分子机制奠定研究基础，为科学防控食源性NoV疫情的暴发、保障牡蛎养殖产业可持续发展提供理论依据，为今后深入开展贝类有毒有害物质特异性蓄积的分子机理研究提供参考思路。
【作者】姜薇；
【导师】翟毓秀；
【作者基本信息】中国海洋大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】太平洋牡蛎；组织血型抗原；类α-1，2-岩藻糖基转移酶；时空表达；

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