PKM2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其对膀胱癌细胞糖代谢和生物学行为的影响

【摘要】背景：膀胱癌是人类泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均占泌尿系肿瘤首位,其中约90%为尿路上皮癌。近十几年来,男性和女性的膀胱癌发病率均呈上升趋势。虽经多年研究,膀胱癌的发生发展的机制目前仍不明确,因此研究膀胱癌发生、发展的分子机制对于膀胱癌的预防及治疗具有重要意义。肿瘤的特征性代谢改变对其生长和增殖具有重要作用。丙酮酸激酶M2亚型(pyruvatekinaseM2isoform,PKM2)催化糖酵解最后一步反应,在多种肿瘤中高表达,且其活性受到多种代谢中间产物和细胞因子等的调控,是肿瘤细胞有氧糖酵解(Warburg效应)的关键调节因子。肿瘤可迅速生成能量并累积糖酵解中间代谢产物用于合成代谢,促进肿瘤的生长和增殖。PKM2在肿瘤代谢和生长中的特殊作用,使其成为肿瘤治疗的可能靶点,对PKM2在膀胱癌中的表达和功能进行研究将有助于阐明相关机制和并具有潜在的应用前景。目的：(1)检测PKM2在膀胱癌组织及细胞株中的表达情况,分析PKM2的表达和膀胱癌临床病理特征之间的关系。(2)构建慢病毒介导的RNA干扰以特异性的敲低PKM2基因,并经药物筛选构建稳定敲低PKM2的膀胱癌细胞株。(3)通过体外试验和体内实验研究PKM2基因敲低对膀胱癌细胞株糖代谢和生物学行为的变化。(4)探索PKM2影响人膀胱癌侵袭、转移的可能机制。方法：(1)收集36例膀胱癌组织及其配对的癌旁组织,采用Western-blot和实时荧光定量-PCR(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,Real-timePCR)及免疫组织化学的方法检测PKM2在膀胱癌组织、配对癌旁组织及膀胱癌细胞株中的表达水平,并分析其表达水平与膀胱癌临床病理特征间的关系。(2)构建靶向PKM2基因的pLV-PKM2-shRNA表达载体,包装病毒后感染膀胱癌细胞株,采用Western-blot和Real-timePCR检测shRNA干扰序列对PKM2表达的影响,筛选最优的shRNA序列进入后续试验。(3)通过药物筛选构建稳定敲低PKM2的膀胱癌细胞株。通过葡糖糖、乳酸测定、CCK8法、流式细胞术、划痕实验、Transwell试验等方法研究PKM2基因敲低对膀胱癌细胞糖代谢、增殖、凋亡、迁移、侵袭等的影响。通过裸鼠成瘤实验观察敲低PKM2对膀胱癌细胞株活体成瘤能力的影响。通过构建膀胱癌原位裸鼠模型和活体小动物发光实验观察PKM2基因敲低对膀胱癌成瘤能力及转移的影响。(4)采用Western-blot和Real-timePCR检测敲低PKM2后上皮间质转化相关标志物的表达变化,探讨PKM2影响膀胱癌细胞侵袭、转移的可能机制。结果：(1)PKM2蛋白和mRNA的表达水平在膀胱癌组织和细胞株中明显增高。PKM2的表达水平与组织学分级和TNM分期正相关。(2)成功构建了3条pLV-PKM2-shRNA和1条pLV-control-shRNA稳定表达的质粒。构建的3条PKM2-shRNA干扰序列均可显著敲低T24细胞PKM2蛋白和mRNA水平的表达,其中PKM2-shRNA-1的干扰效果最显著。(3)体外实验结果显示,敲低PKM2使T24细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成降低、增值、凋亡、迁移和转移能力下降,ROS生成增加,对顺铂的敏感性增加。裸鼠成瘤实验提示敲低PKM2后T24细胞的成瘤重量和成瘤速度降低。原位膀胱成瘤模型提示敲低PKM2后UMUC-3细胞成瘤能力降低,转移灶的数量减少。(4)敲低PKM2后T24的E-cadherin表达上调,而Vimentin、Fibronectin表达下调。结论：(1)PKM2在膀胱癌组织和细胞中高表达,其表达与膀胱癌的组织学分级和TNM分期正相关,PKM2可能在膀胱癌的发生、发展中起重要作用。(2)体内实验和体外实验表明,PKM2基因敲低可抑制膀胱癌细胞的有氧糖酵解、增殖、迁移、侵袭和成瘤能力,并促进ROS生成和凋亡。(3)PKM2可能通过影响上皮间质转化促进膀胱癌的侵袭和转移。图26幅,表27个,参考文献82篇。
【作者】王新君；
【导师】赵晓昆；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】丙酮酸激酶M2型；膀胱癌；RNA干扰；生物学行为；上皮间质转化；波形蛋白；E-粘连蛋白；纤连蛋白；

【参考文献】
[1]杨磊.血清CCL2和IL-10在痛风急性发作患者中的变化及其相关因素分析[D].浙江大学,内科学,2013,硕士.
[2]王兵兵.土地格局时空变化对黄河口湿地鹤类的生境影响研究[D].中国石油大学（华东）,地图制图学与地理信息工程,2012,硕士.
[3]杨青.罗格列酮对THP-1巨噬细胞ABCA1，ABCG1表达和胆固醇代谢的影响[D].辽宁医学院,外科学,2012,硕士.
[4]黄勃.舌面图像特征分析与证候辅助诊断分类研究[D].哈尔滨工业大学,2009.
[5]黄丽英.基于教育技术条件下的语文教学[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[6]杨希.被服面料的综合评价与织物规格参数的关联性探究[D].苏州大学,纺织材料与纺织品设计,2013,硕士.
[7]董万青.隔药饼灸治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的临床观察[D].北京中医药大学,中医外科学,2014,硕士.
[8]张达明.以游戏的心态摘诺奖[J].中国青年,2010,21:65.
[9]李晓君.无人机飞控设计与协同打击地面移动目标仿真研究[D].哈尔滨工业大学,飞行器设计,2013,硕士.
[10]马颖.我国资本充足率监管对银行绩效的影响研究[D].东北师范大学,金融学,2012,硕士.
[11]杨小娟.我国当代边境贸易发展研究[D].西南财经大学,国际贸易学,2014,博士.
[12]项兴尧.电网谐波与无功综合动态补偿研究[D].兰州理工大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[13]郑雪峰,姚琳.轧钢计算机控制系统集成技术[J].冶金自动化,2001,03:63-64.
[14]张瑞.双PEMs差频调制型傅里叶—贝塞尔变换光谱测量技术研究[D].中北大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[15]周吉人.股权结构与公司绩效——上市公司一股独大现象的实证研究[D].对外经济贸易大学,金融学,2004,硕士.
[16]康文静.基于遗传算法的视频摘要模型[D].河北师范大学,无线电物理,2013,硕士.
[17]罗香彬.高速旋转电弧传感焊接系统理论数学模型研究[D].南昌大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[18]王绪娟.基于PDS模式优化高校体育教育专业教育实习模式的研究[D].宁波大学,体育教学,2013,硕士.
[19]程啸.高中历史鉴赏式教学的实践研究[D].广西师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[20]秦艳丽.光敏药物铝酞菁和化疗药物阿霉素在肿瘤治疗中的协同作用研究[D].复旦大学,光学,2012,硕士.
[21]卢炎生,杨芬,赵栋.带单调约束的关联规则挖掘[J].计算机工程,2004,15:78-79+129.
[22]韩彩锐.4SY-1.8型油菜割晒机液压驱动系统设计与试验研究[D].华中农业大学,农业机械化工程,2014,硕士.
[23]王笑朵.环氧合酶-2和血管内皮生长因子在人牙髓中的分布及表达[D].中国医科大学,口腔临床医学,2004,硕士.
[24]郑振叶.钢渣中游离氧化镁的测定和提高钢渣水泥复合胶凝材料水化性能的研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[25]章建华.新闻标题语言的意义表达及其效果[D].西北工业大学,外国语言学及应用语言学,2003,硕士.
[26]白睿.钢框架—防屈曲折板剪力墙抗侧性能研究[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[27]于兴钢.北京与纽约的产业结构变动研究[D].首都经济贸易大学,区域经济学,2014,硕士.
[28]邱佳佳.商鞅变法的法律文化解释[D].郑州大学,法律史,2013,硕士.
[29]谢飞.我国上市公司大股东增持、减持动机及市场效应研究[D].江西财经大学,金融学,2013,硕士.
[30]陆夏.外伤性脑损伤模型大鼠中经颅磁刺激对内源性神经干细胞作用的研究[D].北京协和医学院,临床医学,2014,博士.
[31]杨盈.住院2型糖尿病患者甲状腺结节发病相关因素的分析[D].大连医科大学,内科学,2012,硕士.
[32]鞠明明.具有EMG反馈的植入式脊髓电刺激系统的设计与实现[D].华中科技大学,控制工程,2013,硕士.
[33]李凤伟.黑龙江省三种蛙肝脏中化学成分及其药理作用研究[D].佳木斯大学,生药学,2014,硕士.
[34]马丛丛.山东省南四湖流域生态经济分区定位发展研究[D].曲阜师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[35]张静.决策树分类方法及其在铁路客票营销分析中的应用[D].郑州大学,2003.
[36]陈敏.重庆市主城区大气PM_(10)、PM_(2.5)中PAHs分布规律解析[D].西南大学,环境科学,2013,硕士.
[37]李燕.论我国侦查阶段辩护制度的完善[D].华中师范大学,诉讼法学,2013,硕士.
[38]段园园.脱落酸和茉莉酸甲酯对锁阳茎切口愈合及褐变的调控[D].内蒙古大学,植物学,2013,硕士.
[39]甘圣昊.基于无线传感器网络的人工气候室监控系统研究与实现[D].南京邮电大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[40]谌晓明.深空通信中高效率Turbo码关键技术的研究[D].湖南大学,信息与通信工程,2011,硕士.
[41]霍霄华.现代物流在后方仓库管理中的应用研究[D].中国人民解放军国防科学技术大学,2002.
[42]王海旺.基于遥感和RUSLE的植被指数对小流域输沙影响的研究[D].华中农业大学,水土保持与荒漠化防治,2014,硕士.
[43]汪留洋.地质环境安全与地质环境综合评价方法研究[D].成都理工大学,地质工程,2013,硕士.
[44]张冉.BC地产集团运营绩效管理优化研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[45]沈有信,赵春燕.持久性土壤种子库种子萌发的个体竞争能力会衰减吗?——以紫茎泽兰为例[J].植物生态学报,2012,08:754-762.
[46]姜艳军,吴欣蕊,冯凯,周丽亚,高静.酶基抗生物粘泥复合膜的制备及性能[J].河北工业大学学报,2014,03:31-37.
[47]周莹青.论利益衡量方法在行政审判中的运用[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[48]钱文.基于用户空间的云网关网络文件系统设计与实现[D].华中科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[49]敖翔.我国金融行业员工职业道德建设问题与对策研究[D].华中师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[50]常鑫.地方政府系统中编制外聘用人员管理的问题与思考[D].西北大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.