Niban在肾间质纤维化中的研究

【摘要】第一章肾间质纤维化差异蛋白的筛选研究背景：肾间质纤维化(RenalInterstitialFibrosis,RIF)以肾小管扩张和间质纤维化为特征。研究认为,RIF的程度预示着肾功能受损的程度,与病人肾脏疾病的预后密切相关。RIF是各种慢性肾脏病(ChronicKidneyDisease,CKD)向终末期进展过程中的一种共同病理表现。研究RIF的作用机制,寻找RIF的生物标志物,探索防治RIF的有效措施,对于延缓慢性肾脏疾病的进程意义重大,是目前全球肾病研究的热点和难点。肾间质纤维化的发生、发展受多方面因素的影响,肾小管上皮细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖与活化、肾小管上皮细胞转分化、细胞因子及血管活性物质的产生、细胞外基质合成和降解失衡等均参与其过程。鉴于肾间质纤维化机制的复杂性,我们认为目前已有的研究结果并不能完全解释肾间质纤维化的发病过程,应该还存在尚未引起重视的、可以影响肾间质纤维化过程的新蛋白、新机制。本实验拟通过联合蛋白质组学及基因芯片研究的方法,对肾间质纤维化经典模型——单侧输尿管梗阻(UnilateralUreteralObstruction,UUO)大鼠肾组织中的差异蛋白进行筛选,寻找肾间质纤维化过程的生物标志物。目的：在3天、7天、14天、21天UUO大鼠肾组织中,以蛋白质组学联合基因芯片的分析方法,筛选肾间质纤维化过程中有意义的差异蛋白。方法：建立肾间质纤维化UUO大鼠模型。SD大鼠(25只)随机分为假手术组、3天、7天、14天、21天UUO模型组(每组5只)；于UUO术后3、7、14、21天留取各组大鼠梗阻侧肾脏标本,行HE染色观察大鼠肾间质纤维化程度。MASSON染色、III型胶原免疫组化横断面观察14天UUO大鼠肾间质纤维化成模情况。同位素标记相对和绝对定量(IsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation,iTRAQ)技术筛选3天、7天、14天、21天UUO大鼠肾组织差异蛋白表达谱,并与基因芯片的结果进行配对分析,寻找肾间质纤维化过程中有意义的差异蛋白。结果：(1)HE染色结果提示UUO模型成功,3天、7天、14天、21天UUO大鼠肾组织按时间呈现不同程度的肾小管扩张及间质纤维化。14天UUO组大鼠肾脏的肾间质损伤指数、细胞外基质以及Ⅲ型胶原表达量均比假手术组明显升高(p<0.05)。(2)鉴于我们主要着眼于寻找肾间质纤维化早中期的生物标志物,我们以iTRAQ联合基因芯片筛选3天、7天、14天UUO大鼠肾组织中有意义的差异蛋白。与假手术组比较,UUO术后3天、7天、14天四个时间点,差异蛋白持续上/下调(蛋白表达改变>1.2or<0.8),且满足相对应的基因表达>2.0or<0.5的蛋白,共15个；其中持续上调的差异蛋白共9个；持续下调的差异蛋白共6个(包括Niban)。(3)Niban与肾间质纤维化的关系尚不明确,故确定Niban为本研究组后续研究的目标蛋白,重点研究Niban在肾间质纤维化中的表达及可能的作用机制。第二章Niban在肾间质纤维化中的表达研究背景：Niban是2000年由Majima首次发现的蛋白,主要在细胞质中表达。Niban最早在Eker大鼠(一种遗传性肾脏肿瘤的大鼠模型)中发现。在人和动物的其他肾脏肿瘤、患者头颈部鳞癌、头颈部发育不良组织、酗酒／嗜烟及甲状腺损伤患者粘膜上皮组织中,Niban均表达升高。Niban可能作为一种早期肿瘤标志物,对细胞起促进增殖、抑制凋亡的作用。基于本研究组前期实验中Niban在蛋白质组学及基因芯片中的结果,本章节拟对Niban与肾间质纤维化的关系进行验证。目的：通过病人、动物及细胞实验,进一步以体内外实验对肾间质纤维化中Niban蛋白及mRNA表达进行验证。方法：免疫组织化学法对梗阻性肾病患者肾组织中Niban蛋白表达进行定位及半定量检测；免疫组织化学法、WesternBlot法对UUO大鼠肾组织中Niban蛋白表达进行定位及半定量检测；Realtime-PCR检测NibanmRNA的表达。以TGF-β1(10ng/ml)孵育HK-2细胞48小时,诱导HK-2细胞凋亡,构建体外肾间质纤维化模型。WesternBlot法检测TGF-β1诱导的HK-2细胞中Niban、FN的表达,进一步在体外实验中验证肾间质纤维化时Niban的表达情况,FN评估HK-2细胞纤维化状态。结果：1)梗阻性肾病患者肾组织中Niban表达较正常对照组明显减少；2)UUO大鼠肾组织中Niban蛋白表达较假手术组明显减少；而UUO大鼠肾组织中NibanmRNA表达较假手术组升高；3)TGF-β1孵育HK-2细胞48小时后,FN表达升高,Niban表达减少。结论：1)Niban在UUO大鼠及梗阻性肾病患者肾组织中表达减少；2)Niban在TGF-β1诱导的体外肾间质纤维化模型(HK-2)中表达减少。第三章Niban在肾间质纤维化中的作用机制探讨研究背景：肾间质纤维化以肾小管扩张和间质纤维化为特征,与慢性肾脏病的进展密切相关。肾间质纤维化的程度预示着肾功能受损的程度,与患者肾脏疾病的预后关系密切。肾间质纤维化的作用机制复杂,涉及到多个步骤及环节,肾小管上皮细胞凋亡、转分化、巨噬细胞浸润、炎症、氧化应激、多种细胞因子及血管活性物质产生等均参与肾间质纤维化的过程。其中,凋亡在诱发肾小管上皮细胞萎缩及肾间质纤维化形成中起重要作用。凋亡(Apoptosis)也称为“程序性细胞死亡”或“细胞自杀”,是一种遗传控制的生理性死亡。在正常情况下,凋亡起消除老化细胞或未参与免疫反应的淋巴细胞的作用；而发生病理性改变时,凋亡则可以对肿瘤生成在内的多种病理情况起作用。时至今日,已经在多种肾病模型和临床患者肾脏病理检测中,观察到了肾小管上皮细胞的凋亡现象。Niban的相关研究显示,它是一种功能蛋白。Niban可以通过影响真核转录起始因子——eIF2α及S6K1／4E.BP1磷酸化,在转录水平调节细胞死亡信号；Niban还通过竞争性拮抗MDM2(AKT通路下游的一个作用底物),导致P53降解增多,发挥抑制凋亡的作用.Niban在肾纤维化领域的作用研究,尚不明确。基于Niban对肿瘤细胞凋亡的调控作用,以及上一章我们对Niban在肾间质纤维化中表达的验证,本章节拟对Niban在肾小管上皮细胞凋亡中的作用进行观察,以探讨Niban在肾间质纤维化中的可能作用机制。目的：观察UUO大鼠肾组织及TGF-β1(10ng/ml)孵育48小时后肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡情况；观察iban表达量改变(沉默或过表达)时,对肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法：TUNEL法检测UUO大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况；TUNEL法及流式细胞仪检测TGF-β1孵育48小时后HK-2细胞凋亡情况；TUNEL法及流式细胞仪检测siRNA沉默Niban后HK-2细胞凋亡情况；WesternBlot法对siRNA沉默Niban的效果进行检测；流式细胞仪检测Niban质粒转染后HK-2细胞凋亡情况。结果：1)与假手术组相比,UUO组大鼠肾小管上皮细胞凋亡明显增加；2)与对照组相比,TGF-β1孵育后HK-2细胞凋亡明显增多；3)siRNA沉默Niban后,HK-2细胞凋亡增加,与对照组相比,差异有统计学意义；4)Niban质粒转入HK-2细胞,TGF-β1干预后细胞凋亡未见减少。结论：1)肾间质纤维化时,肾小管上皮细胞凋亡增加,Niban表达减少,两者趋势相反；2)沉默Niban的表达,可以引起HK-2细胞凋亡增加,提示Niban可能参与肾小管上皮细胞凋亡所致的肾间质纤维化；3)Niban在肾间质纤维化中对HK-2细胞凋亡的调节,不通过TGF-β1通路。
【作者】刘纪实；
【导师】陶立坚；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】肾间质纤维化；蛋白质组学；基因芯片；Niban；UUO大鼠；肾小管上皮细胞；凋亡；

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