源自嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫化物:醌氧化还原酶的特征、结构和机理研究

源自嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫化物:醌氧化还原酶的特征、结构和机理研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-23 分类:毕业论文 喜欢:2219
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【摘要】硫化物:醌氧化还原酶(Sulfide:quinoneoxidoreductase,SQR)是一个能将硫化物(包括H2S,HS-和S2-)氧化为零价的硫,并将电子通过辅基FAD传递给醌,将醌还原为氢醌的外周膜蛋白。在浸矿细菌嗜酸氧化亚铁硫杆菌中,SQR是其硫化物氧化途径的第一个酶,在它的整个硫代谢系统中扮演着十分重要的角色。本论文在大肠杆菌中异源表达并纯化获得具有活性的源自嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC23270的SQR蛋白,并系统地研究了SQR的酶学特性、亚细胞定位、系统发育分类、三维结构和硫化物:醌氧化还原反应机理。SQR重组蛋白的分子量为48kDa,具有硫化物:醌氧化还原活性,其动力学常数Km[Na2S]和Km[DUQ]分别为6.3μM和14.6μM。其最大反应速度Vmax为0.49±0.05μmoles/min/mg。SQR的酶活性最适pH为7.0,在pH5.0~8.0范围内均保持较高活性,在pH2.0时几乎没有活性;SQR酶活性的最适温度为30℃,在20℃时仍然保留了30%的活性。SQR在0℃,23℃,30℃能稳定保持酶活性,在2.5h后仍有80%-90%的酶活力剩余;但是在45℃条件下不稳定,其活性半衰期为约1h。每molSQR中含有1mol非共价键结合的辅助因子FAD,其紫外可见光谱和萤光光谱具有典型黄素蛋白的特征光谱性质—在375nm和450nm处有最大峰值。在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的亚细胞定位研究表明SQR是一个位于周质空间的外周膜蛋白,它通过疏水作用与细胞内膜结合。运用定点突变的方法对SQR中三个高度保守的半胱氨酸残基的研究表明,突变体Cys128Ser失去全部基于DUQ的活性,突变体Cys128A仅剩30-35%基于DUQ的活性,而它们基于FAD的活性则与野生型SQR的活性基本保持一致;突变体Cys160Ala失去了全部基于DUQ的活性,但仍残留约10%基于FAD的活性;突变体Cys356Ala失去了全部基于DUQ和基于FAD的活性。根据活性分析结果推断在硫化物氧化及硫链(硫环)延长的过程中各个半胱氨酸的作用可能是:Cys356是硫化物氧化过程中最重要的半胱氨酸,参与硫化物的氧化及电子从硫化物到FAD的传递;Cys160参与硫化物氧化和硫链延长的反应,但它可能不参与该反应的第一步或最初几步;Cys128的作用可能是用于释放硫环(或硫链)使反应继续循环。本论文首次解析了源自嗜酸氧化亚铁硫杆菌的SQR及其突变体的三维结构,嗜酸氧化亚铁硫杆菌的SQR由两个串联的Rossmann折叠结构域和一个非常灵活易曲的C-端结构域组成,该C-端结构域含有两个亲水脂性的α螺旋,其功能可能与膜结合有关;同时,SQR的结构中还含有一个非共价结合的FAD辅基,结合于第一个Rossmann折叠结构域。SQR的硫化物氧化位点包括两个半胱氨酸(Cys160和Cys356),FAD辅酶和(可能相关的)第三个半胱氨酸(Cys128)。辅基FAD位于Cys160和Cys356的附近,其异咯嗪环的C4A原子和Cys160或Cys356的巯基硫原子之间的距离均约为5A。这两个半胱氨酸残基位于异咯嗪环的同一侧(reside),且二者间的连线和异咯嗪环的平面几乎平行。SQR中的醌(DUQ)与蛋白接触的原子多数为疏水性,醌的芳香环基团位于两个苯丙氨酸(Phe394和Phe357)的苯环之间,形成一个类三明治结构的结合。DUQ的苯醌头部也靠近FAD的异咯嗪环,苯醌头部的04原子和FAD的02原子之间的距离小于3A,疏水的癸基碳链所朝方向与双亲性α螺旋的方向相反。综合酶学特性和结构特征方面的信息,本论文提出了一个更适合于嗜酸氧化亚铁硫杆菌SQR的反应机理,即以Cys356-S-S-作为亲核体攻击辅基FAD的C4A原子,多聚硫链在Cys160上逐步变长,形成一个八硫环,该八硫环随即被Cysl28释放。图76幅,表14个
【作者】张燕飞;
【导师】柳建设;
【作者基本信息】中南大学,微生物学,2013,博士
【关键词】嗜酸氧化亚铁硫杆菌;硫化物;醌氧化还原酶;黄素蛋白;X射线晶体学;反应机理;

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