NF-κB/HIF-1α诱导乏氧人肺腺癌细胞顺铂耐药及EGCG增敏作用初探

【摘要】背景肺腺癌是非小细胞肺癌的一种病理类型。目前,其发病率在世界许多国家和地区均呈显著上升趋势。肺腺癌具有早期远处转移的特点。因此,以铂类为基础的联合化学是其主要的治疗方法。然而,由于铂类药物耐药及毒性作用,常导致化疗失败。肿瘤细胞耐药机制复杂。近年来,研究发现肿瘤乏氧微环境可能是诱导细胞化疗耐药的始动因素。局部组织乏氧是实体瘤的特征之一。乏氧使肿瘤细胞内HIF-1α表达增多。HIF-1α是目前介导细胞缺氧反应最关键的特异性转录因子,对多种缺氧反应基因具有转录激活作用,不仅与细胞乏氧环境中的适应性生存密切相关,而且通过上调多药耐药蛋白及凋亡抑制蛋白的表达诱导肿瘤细胞化疗耐药,是目前研究乏氧条件下肿瘤化、放疗耐药的热点及逆转化、放疗耐药的靶点。然而,随着对肿瘤乏氧微环境及HIF-1α研究的日臻深入,发现NF-κB在乏氧环境中被异常激活,而且在转录和翻译两个水平上调控HIF-1α的表达。据此,我们推测抑制NF-κB的激活有望通过下调HIF-1α及其通路的表达成为逆转乏氧条件下肿瘤细胞化疗耐药的新靶点。同时,寻找一种天然的、安全的物质逆转乏氧诱导的化疗耐药成为当务之急。目的探讨乏氧条件下人肺腺癌细胞中NF-κB、HIF-1α的表达对化疗敏感性的影响以及EGCG能否逆转细胞化疗耐药及可能机制。方法采用CoCl2构建离体人肺腺癌A549细胞化学乏氧模型。第一部分：人肺腺癌A549细胞分为常氧对照组(control组)、CoCl2(100、200uM)实验组。细胞免疫组织化学及Westernblot检测各组A549细胞HIF-1α的表达；光镜、电镜观察各组A549细胞的形态、结构；MTT法绘制各组A549细胞生长曲线；流式细胞仪检测各组A549细胞周期分布；MTT法检测各组A549细胞顺铂IC50;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测顺铂诱导各组A549细胞的凋亡率。第二部分：人肺腺癌A549细胞分为常氧对照组(control组)、200uMCoCl2乏氧组(CoCl2组)。首先,通过免疫荧光细胞化学、Real-timePCR、Western-blot等技术检测人肺腺癌A549细胞NF-KBp65、HIF-1α的表达；然后,常氧条件下通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染A549细胞p65-siRNA、FITC-conjugatedcontrol-siRNA或加入HIF-1α特异性抑制剂YC-1,再于200uMCoCl2化学乏氧条件下继续培养。A549细胞分为空白对照组(control组)、200uMCoCl2乏氧组(CoCl2组)、p65-SiRNA+200uMCoCl2(p65-siRNA组)、Control-siRNA+200uMCoCl2乏氧组(Control-siRNA组)、Lip+200uMCoCl2乏氧组(Lip组)及YC-1+200uMCoCl2乏氧组(YC-1组),通过Real-timePCR、Western-blot等技术检测人肺腺癌A549细胞NF-κBp65、HIF-1α的表达。第三部分：人肺腺癌A549细胞分为常氧对照组(control组)、200uMCoCl2乏氧组(CoCl2组)、p65-SiRNA+200uMCoCl2(p65-siRNA组)、Control-siRNA+200uMCoCl2乏氧组(Control-siRNA组)、Lip+200uMCoCl2乏氧组(Lip组)及YC-1+200uMCoCl2乏氧组(YC-1组)。首先,MTT法检测各组A549细胞顺铂IC50;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测转染或加入YC-1单独或联合顺铂时A549细胞的凋亡率。然后,Western-blot检测各组A549细胞中Bcl-2、p27的表达,MTT法绘制各组A549细胞生长曲线；流式细胞仪检测各组A549细胞周期分布并与各组顺铂诱导A549细胞凋亡率行相关分析。第四部分：人肺腺癌A549细胞分为常氧对照组(control组)、200uMCoCl2乏氧组(CoCl2组)。培养24小时后,CoCl2组加入不同浓度EGCG。MTT法测检测EGCG单独或联合顺铂时对A549细胞的生长的影响；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测EGCG对A549细胞凋亡率的影响;Hoechst染色法观察A549细胞形态；Western-blot检测A549细胞中Bcl-2的表达。结果第一部分：细胞免疫组化及Western-blot检测结果示CoCl2组A549细胞核内HIF-1α表达较常氧对照组明显增多；光镜下CoCl2组A549细胞较常氧对照组稀疏,电镜下出现线粒体肿胀、内质网扩张及自噬泡形成等微观结构改变；常氧对照组A549细胞生长曲线呈S型,CoCl2组A549细胞生长曲线低平、增殖缓慢、G1期细胞增多、S期细胞减少；CoCl2组A549细胞凋亡率较常氧组无明显增加,在相同浓度顺铂作用时其细胞的存活率及顺铂ICso均较常氧对照组增加,顺铂诱导细胞凋亡率较常氧对照组降低。第二部分：CoCl2组A549细胞中NF-λBp65mRNA转录及总蛋白中NF-κBp65表达较常氧对照组无明显增加,细胞核中NF-κBp65、HIF-1α蛋白表达及HIF-1αmRNA转录均较常氧组对照增加；p65-siRNA组A549细胞中NF-κBp65、HIF-1α在mRNA转录和蛋白表达均较CoCl2组明显下降,YC-1组A549细胞中HIF-1α在蛋白表达较CoCl2组减少。第三部分：p65-siRNA组、YC-1组A549细胞在相同浓度顺铂作用时的存活率及顺铂ICso均较CoCl2组减少；单独或与顺铂联合作用时,凋亡率均较CoCl2组明显增加；Bcl-2、p27表达较CoCl2组降低；细胞增殖短暂加速,S期细胞比例上升,与顺铂诱导细胞凋亡呈正相关。第四部分：EGCG组A549细胞随着EGCG干预浓度的增加生长明显抑制,与顺铂联合时对CoCl2化学乏氧条件下A549细胞生长抑制起协同作用；EGCG组A549细胞凋亡细胞较CoCl2组增加；Western-blot检测结果示EGCG组A549细胞内Bcl-2表达较CoCl2组减少。结论CoCl2化学乏氧条件下NF-κB/HIF-1α通路激活可能通过上调Bcl-2、p27的表达,诱导A549细胞产生凋亡抑制、增殖缓慢、G1/S期阻滞等机制降低顺铂化疗敏感性。EGCG作为一种天然的抗肿瘤药物,与顺铂联合时通过诱导细胞凋亡对CoCl2化学乏氧条件下A549细胞生长抑制起协同作用,下调Bcl-2的表达可能使其机制之一。
【作者】李芳；
【导师】胡成平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】肺腺癌；化学缺氧；NF-κB；HIF-1α；p27；Bcl-2；化疗耐药；EGCG；

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