兔VX2肝癌动脉栓塞磁感应热疗的关键问题研究

【摘要】研究背景肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球恶性肿瘤的第五位。外科手术为肝功能尚好的局限性肝癌患者的首选,但大多数患者在诊断时已处于晚期,失去了手术机会。肝癌对化疗、放疗及激素治疗均不敏感。有文献报道46℃以上的温度可引起组织的凝固性坏死,因此很多患者选择了经皮消融,包括射频、激光、微波及高能聚焦超声等,但这些方法存在一定的局限性,如组织内热剂量分布极度不均匀,易对临近重要组织器官造成热损伤,对体积较大的深部肿瘤作用有限等,从而限制了它们在临床上的应用。经过近20多年的发展,动脉栓塞化疗已成为不能手术的肝癌患者的首选,其通过选择性阻断肿瘤的供血动脉连同化疗药物的细胞毒作用发挥抗癌作用,近期有效率可达30%-70%。但是单纯的动脉栓塞化疗并不能取得满意效果,有研究发现,动脉栓塞化疗后由于肿瘤的供血动脉被阻塞,肿瘤组织缺氧加重,而这可引起潜在的高复发转移。因此寻求更有效的肝癌治疗手段势在必行。近年来,国内外很多学者对动脉栓塞热疗治疗肝癌进行了研究。动脉栓塞热疗是动脉栓塞治疗与磁感应热疗相结合的产物,它是将磁性栓塞介质通过介入的方法导入肿瘤的供血动脉,然后将其置于外加交变磁场下感应升温,即在栓塞肿瘤血管的基础上辅以热疗,给予其双重打击,从而达到治疗肿瘤的目的。其优点在于与动脉栓塞化疗相比,其副作用更少,而且可以实现反复多次无创性治疗；另外,栓塞后处于缺氧状态的肿瘤细胞对热相对敏感,从而更有利于肿瘤细胞的灭活。关于动脉栓塞磁感应热疗,目前研究较多的方向有：栓塞介质,磁场发生装置,升温速率以及抑瘤率等。而研究较多的磁性栓塞介质主要集中在纳米级Fe304和γ-Fe2O3,这些磁性纳米粒子与碘油混合成为磁性液体,有学者认为磁性液体在组织中渗透性强,对外加磁场场强要求低,因此更具有应用于热疗的潜能,但其局限性在于纳米级铁磁颗粒极易通过毛细血管网进入体循环,存在极大的安全隐患；因此,有学者认为动脉栓塞介质应该是微米级的,这样才能确保能将肿瘤毛细血管栓塞,而不会回流至静脉循环。羰基铁粉是一种元素铁,美国InternationalSpecialtyProducts公司生产的微米级羰基铁粉(商品名Ferronyl(?))口服使用的安全性高,已被美国FDA批准用于人体补铁。本课题组创新性的将其应用于体内外实验,证实了它是一种粒径在2-10μm之间的磁性颗粒,在体内外均具有良好的升温性能,并且安全、无毒,具有良好的生物相容性,认为其作为肝动脉栓塞热疗介质是安全可行的。而与安全性相关的另外一方面在于磁性颗粒在正常肝组织及其他重要器官中的分布,若栓塞过程中出现非靶向性栓塞,则会对其他正常组织器官造成机械性损伤以及在后续的热疗过程中造成热损伤,使治疗增益比下降；同时磁性颗粒在肿瘤中的含量及分布又决定了其治疗的疗效。目前国内外尚无羰基铁粉在此方面的研究与报道。本课题从以下三大部分进行研究：第一部分,将羰基铁粉与碘油混合作为栓塞介质栓塞正常兔肝动脉,探讨其在正常肝动脉中的分布,并观察其是否能通过肝动脉和细胞膜进入肝细胞内；第二部分,分别通过核磁共振成像(MRI)和电感耦合等离子发射光谱法(ICP-AES)定性和定量分析羰基铁粉在肿瘤及其他重要器官中的分布,并探讨其体内代谢途径；第三部分,对羰基铁粉介导的兔VX2肝癌的动脉栓塞热疗疗效及作用机制进行研究。第一章羰基铁粉-碘油混悬液栓塞后在正常兔肝脏中的分布研究目的探讨羰基铁粉-碘化油混悬液作为动脉栓塞热疗介质在正常肝组织内的分布及对肝细胞的影响,为进一步的荷瘤兔栓塞热疗实验提供参考。方法将羰基铁粉-碘油混悬液经肝动脉注入8只正常新西兰大白兔肝内,栓塞后24h处死,立即取肝组织浸泡于10%福尔马林溶液中,石蜡包埋,切片,HE和普鲁士蓝染色,行病理组织学检查。石蜡切块改制行超薄切片检查。结果栓塞后所有实验兔一般情况较差,精神、食欲不佳,但均存活至处死。HE染色可见在羰基铁粉颗粒沉积的周围有组织坏死,普鲁士蓝染色可见羰基铁粉在肝动脉内聚集,并且有部分铁粉进入肝索、肝窦及Disses腔,还有部分羰基铁粉进入肝细胞,甚至进入肝细胞核。透射电镜超薄切片进一步证实有部分羰基铁粉进入肝细胞核,并沉积在细胞核核仁。结论羰基铁粉-碘油混悬液栓塞正常兔肝动脉后,可使供血区域细胞坏死,证实了其具有动脉栓塞效果；同时部分羰基铁粉可进入肝细胞核,为细胞内热疗提供了理论基础,同时对药物导向的细胞内热化疗具有一定的研究价值。第二章羰基铁粉-碘油混悬液在VX2肝肿瘤及其他重要器官中的分布及体内代谢途径研究目的分别利用MRI扫描定性和ICP-AES法定量检测羰基铁粉在兔VX2肝肿瘤及其他重要器官中的分布,并初步探讨其代谢途径。方法将接种18天的40只荷瘤兔随机分为两大部分：第一部分：8只,分别于栓塞前及栓塞后第1、3、14天行MRI扫描,最后一次MRI扫描后全部处死,取出肿瘤及正常肝、肺、脾等重要器官,行病理组织学检查；第二部分：32只,分为4组(A、B、C、D),每组8只：A组即刻处死、B组于栓塞后第1天处死、C组于栓塞后第3天处死、D组于栓塞后第14天处死,所有实验兔均于处死后即刻取出肿瘤、正常肝、肺、脾、胆囊等组织,将各离体组织在烘箱(110℃)烘干至恒重,研磨成粉末状,ICP-AES法检测各组织中铁含量。结果(1)栓塞后各组实验兔均有不同程度的精神萎靡,活动和进食相对减少,但一般在栓塞后3天其精神状况、活动和进食逐渐恢复正常。(2)栓塞前肿瘤在T2WI相呈现不均匀高信号影,栓塞后第1、3、14天原肿瘤部位均呈极低信号影,其周围少量正常肝组织也呈低信号影；随着栓塞后时间的延长,正常组织中低信号影有所回升,而原肿瘤部位仍呈极低信号影。(3)栓塞后各时间点正常肝组织、肿瘤组织中铁含量均较栓塞前升高(P<0.001),肿瘤组织与正常肝组织中铁含量比值平均为4.55：1；随着栓塞后时间的延长,肿瘤组织与正常肝组织中铁含量均有所下降,但正常肝组织中下降更明显(P=0.002vsP=0.012)。(4)栓塞后各时间点肺组织中铁含量与栓塞前比较未见明显变化(P>0.05)。(5)栓塞后各时间点脾脏中铁含量均较栓塞前增高(P<0.001)。(6)栓塞后各时间点胆囊中铁含量较栓塞前显著升高(P<0.001),但是随着时间的延长,栓塞后第3天、第14天胆囊中铁含量较栓塞后第1天明显下降(P<0.05)。结论MRI可以探测出肝组织内一定浓度的铁,了解正常肝组织的羰基铁粉有无过量的沉积,从而可以避免在外加交变磁场中正常肝组织因铁含量过高而引起的热损伤。羰基铁粉-碘油混悬液栓塞兔VX2肝肿瘤具有较强的靶向性。栓塞前后肺组织中未见明显铁沉积进一步证实了栓塞热疗的安全性。肝脏、脾脏和胆道-肠道排泄可能是羰基铁粉-碘油混悬液体内代谢的三条途径。第三章兔VX2肝肿瘤动脉栓塞热疗的疗效分析及机制研究目的探讨羰基铁粉-碘油混悬液栓塞兔VX2肝肿瘤的疗效及作用机制。方法将接种18天的32只荷瘤兔随机分为四组(每组8只),即对照组(未处理组)(A组),碘油栓塞组(B组),羰基铁粉-碘油混悬液栓塞组(C组),羰基铁粉-碘油混悬液栓塞热疗组(D组)。各组实验兔分别于栓塞前行MRI及CT扫描,评价肿瘤模型建立情况,观察各组实验兔的生存期,观察终点时处死并测量肿瘤大小,计算抑瘤率,大体观察标本及进行病理组织学检查,利用SABC免疫组化法检测各组实验兔肿瘤组织中VEGF及MMP-9的表达。结果(1)D组较其他三组兔的生存期显著延长(P<0.001),B、C两组与A组相比较其生存期也有显著性差异(P<0.05、P<0.001),B、C两组生存期组间比较无显著性差异(P>0.05)。(2)各组兔栓塞前体积无明显差异(P>0.05)。处死时B、C、D组实验兔肿瘤大小较A组明显减小(P<0.001),D组实验兔肿瘤体积较B、C组实验兔肿瘤体积减小(P<0.001),B、C组之间体积无明显差异(P>0.05),各组实验兔抑瘤率分别为：B组：64.67%,C组：74.60%,D组：95.86%。(3)肉眼及显微镜下观察：大体标本观察D组肿瘤体积较其他三组明显减小,D组实验兔肺部转移结节较其他三组实验兔少而小,A组实验兔有2例脾脏、1例肾脏及1例腹腔广泛转移,而其他三组未见除肺组织以外的远处转移；显微镜下观察D组肿瘤组织较其他组更少,可见大片坏死,仅残留散在分布的小片状癌巢,C、D组肿瘤微动脉内可见羰基铁粉颗粒及碘油沉积,B、C、D三组实验兔正常肝组织中也可见极少量羰基铁粉或碘油沉积,但其大体结构未受影响,仅极少数被栓塞的微动脉周围出现肝组织萎缩、变性。各组肺组织无萎缩、变性及坏死。(4)D组肿瘤组织VEGF、MMP-9阳性表达率较A、B、C组均低,具有统计学意义(P<0.001)。B、C组VEGF、MMP-9阳性表达率均明显低于A组(P<0.001)。B、C组组间肿瘤组织VEGF、MMP-9阳性表达率无显著性差异(P>0.05)。结论羰基铁粉-碘油混悬液介导的肝动脉栓塞热疗能有效的抑制兔VX2肝肿瘤的生长,延长实验兔的生存期,抑制肿瘤新生血管的生成,减少肿瘤的浸润和远处转移。
【作者】李立；
【导师】唐劲天；钟美佐；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】栓塞介质；羰基铁粉；细胞内热疗；药物导向；MRI；ICP-AES；分布；VX2肝肿瘤；动脉栓塞；热疗；肝动脉栓塞；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶；VEGF；MMP-9；

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