重症肌无力差异LncRNAs的表达及生物信息学研究

【摘要】目的：通过lncRNA芯片分析重症肌无力并发胸腺瘤患者组和重症肌无力胸腺无异常组及健康对照组的差异lncRNAs和mRNA表达；运用生物信息学方法,预测并分析差异lncRNA的共表达靶基因、lncRNA的生物学功能聚类以及参与的信号通路,通过cis和trans预测分析差异lncRNA参与基因调控中作用机制,构建TF-lncRNA-靶基因三者的网络关系；采用real-timePCR技术,验证代表性具有差异表达的lncRNAs;为探讨lncRNAs在重症肌无力患者发病机制中的作用奠定基础。方法：1.收集重症肌无力患者及健康正常对照组患者外周血标本,分离外周血淋巴细胞并提取总RNA。2.通过lncRNA芯片,检测和分析重症肌无力患者外周血的lncRNA与mRNA表达谱,以差异倍数大于或等于2,且p小于等于0.05为标准,筛选出重症肌无力并发胸腺瘤患者组与健康对照组比较存在的差异表达lncRNA和mRNA分子。3.通过生物信息学分析,预测靶基因、分析基因聚类、预测富集生物学通路以及构建TF-lncRNA-靶基因网络关系：利用pearson相关系数预测差异表达的lncRNA的靶基因；针对差异性表达的lncRNA的靶基因,应用ENCODE数据库预测可能富集的生物学信号通路,进行基因聚类（GO与pathway）分析,关联分析构建lncRNA-mRNA共表达网络；采用Cytoscape构建TF-lncRNA-靶基因三元网络关系4.实时荧光PCR验证具有代表性差异表达lncRNAs:选取lncRNA芯片检测具有代表性显著差异表达的lncRNAs,采用real-timePCR技术,验证其在重症肌无力并发胸腺瘤组和无胸腺异常组及健康对照组中的差异表达。结果：1.lncRNA芯片分析显示,重症肌无力胸腺瘤患者组和健康对照比较存在1489个显著差异lncRNA分子,其中218个上调,1271个下调；有862个差异的mRNA分子,其中上调的mRNA有249个,下调的mRNA有613个。重症肌无力胸腺无异常患者组和健康对照比较存在342个显著差异lncRNA分子,其中172个上调,170个下调；存在353个差异的mRNA分子,其中上调的mRNA有263个,下调的mRNA有90个。重症肌无力并发胸腺瘤组和重症肌无力胸腺无异常组比较存在281个差异显著lncRNA分子,其中52个上调,229个下调。存在204个差异的mRNA分子,其中上调的mRNA有59个,下调的mRNA有145个。2.在重症肌无力并发胸腺瘤与健康对照组,首先选取差异显著性上调lncRNAoebiotech11933、lncRNAA24P927716和下调显著性lncRNAA21P0010030、lncRNAA21P0002844逐一分析其共表达靶基因、GO和pathway,并采用real-timePCR验证其表达,整体差异lncRNA的GO功能和pathway分析结果显示,细胞对干扰素γ的响应在重症肌无力并发胸腺瘤发病机制中发挥重要的作用,其次依次为正向调节细胞因子产生、调节平滑肌细胞增殖、细胞因子受体结合等生物学功能。通过cis确定了17个lncRNA在染色体上的调控关系；同时通过trans作用机制分析,构建了CTCF、TAF1等转录因子与差异lncRNA的二元组关系及其网络,与mRNA的共表达关系构建CTCF—lncRNAoebiotech24272—SOST等三元互相调控网络。3.在重症肌无力胸腺无异常组与健康对照组中,选取差异显著性上调lncRNAoebiotech11933、lncRNAoebiotech03926和下调显著性lncRNAoebiotech02627、lncRNAoebiotech22482逐一分析其共表达靶基因、GO和pathway,采用real-timePCR验证其表达,整体差异lncRNA的GO功和pathway分析结果显示,血小板脱粒化和细胞对干扰素的响应在其中发挥重要的生物学功能,其次依次为调节细胞因子转导、负向调节离子运输、炎症反应、糖皮质激素刺激、调节细胞因子生成过程等生物学功能,通过cis确定了6个lncRNA在染色体上的调控关系；通过trans作用机制分析,构建了CTCF、MYC等转录因子与差异lncRNA的二元组关系及其网络,与mRNA的共表达关系构建CTCF—lncRNAA21P0007083—NUS1等三元互相调控网络。4.在重症症肌无力胸腺瘤组与重症肌无力胸腺无异常组,选取差异显著性上调lncRNAoebiotech13222、lncRNAA19P00315959和下调显著性lncRNAoebiotech22652,lncRNAoebiotech16223逐一分析其共表达靶基因,GO和pathway,采用real-timePCR验证其表达。整体差异lncRNA的GO功能和pathway分析显示,确定趋化因子受体结合,细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路在其中发挥重要的生物学功能,其次分别是正向调节白细胞的迁移运动,细胞因子转导、离子的运输等生物学功能。通过cis确定了6个lncRNA在染色体上的调控关系；通过trans作用机制分析,构建了CTCF—lncRNAoebiotech22642—SMCR7L等三元互相调控网络。5.整体差异lncRNA的GO功能和pathway分析结果显示,与健康对照组比较,无论MG是否合并胸腺瘤,细胞对干扰素γ的响应均在发病机制中发挥重要的作用；而MG合并胸腺瘤组与胸腺无异常组比较,趋化因子受体结合,细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路在其中发挥重要的生物学功能,其次分别是正向调节白细胞的迁移运动,细胞因子转导、离子的运输等生物学功能。结论：1.通过lncRNA芯片分析发现了重症肌无力并发胸腺瘤患者组和重症肌无力胸腺无异常组及健康对照组的差异表达的lncRNAs和mRNAs。2.通过分析三组部分差异lncRNA的cis和TF调控关系,确定了lncRNA在染色体上的调控关系。3.通过trans作用机制分析,构建了CTCF—lncRNAoebiotech22642—SMCR7L等三元互相调控网络。
【作者】李业；
【导师】肖波；杨欢；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】lncRNA；mRNA；重症肌无力；胸腺瘤；实时荧光定量PCR；生物信息学分析；

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