干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白及其免疫效力的研究

【摘要】本研究利用干酪乳杆菌表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白，通过口服方式免疫鸡，诱导机体局部黏膜免疫和全身系统免疫应答。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段，将目的片段构建在pLA穿梭质粒上，经过PCR验证，正确的命名为pLA-VP2。pLA-VP2重组质粒在大肠杆菌中经克隆增殖后，提取质粒，然后电转化到干酪乳杆菌中，再经过提取质粒，PCR验证，正确的命名为pLA-VP2/L.casei。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2，得到约90KDa的融合蛋白，与预期结果相符。Westernblot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应，具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光，且pLA-VP2/L.casei荧光强度强于pLA/L.casei对照组，应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率，约为80%。结果表明，IBDVVP2蛋白已成功展示在干酪乳杆菌表面。以构建的pLA-VP2/L.casei免疫雏鸡，诱导机体局部黏膜免疫和全身系统免疫应答，并通过攻毒检测重组干酪乳杆菌免疫保护效力。为了确定免疫次数和免疫剂量，用pLA-VP2/L.casei免疫5日龄雏鸡，试验组分别设二次免疫组和三次免疫组，每组免疫不同浓度（108、109、1010CFU/mL)的重组干酪乳杆菌，并设对照组。间接ELISA检测血清IgG和小肠冲洗液sIgA，最后一次免疫后7d攻毒，检测pLA-VP2/L.casei保护效果。根据确定的免疫次数和免疫剂量免疫5日龄雏鸡，分别设口服pLA-VP2/L.casei组、滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组、口服商品活苗组、肌注商品活苗组、pLA/L.casei组和PBS组，免疫后于不同时间分别应用间接ELISA检测鸡胃肠道冲洗液、肺泡冲洗液、眼结膜鼻腔冲洗液中特异性sIgA抗体和血清中抗IBDV特异性IgG抗体水平；在最后一次免疫后7d检测脾淋巴细胞增殖情况，并对各组鸡进行攻毒，7d后剖检，观察法氏囊组织损伤程度，记录法氏囊病变得分和保护率。通过试验结果分析确定免疫次数为2次，免疫剂量为109CFU/ml。试验各组的特异性sIgA、IgG抗体水平显著高于PBS对照组（P<0.01），pLA-VP2/L.casei口服免疫保护效果优于滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei组，淋巴细胞增殖试验结果显示口服pLA-VP2/L.casei组细胞免疫水平显著高于其他组（P<0.01）；法氏囊病变得分表明pLA-VP2/L.casei安全性优于商品活苗组。因此，构建的重组干酪乳杆菌可以作为候选疫苗预防传染性法氏囊病毒感染。
【作者】林红丽；
【导师】侯喜林；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】传染性法氏囊病毒；VP2蛋白；重组干酪乳杆菌；黏膜免疫；

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