Mcl-1和IAPs家族蛋白介导肝癌细胞抗凋亡作用及其分子机制的研究

【摘要】凋亡是程序性细胞死亡，细胞凋亡主要通过内源性、外源性2个信号传导通路。许多研究证明，肝细胞肝癌（HCC）细胞内源性凋亡缺陷是导致化疗失败的原因之一。Bcl-2家族蛋白是控制细胞生存与死亡的关键蛋白，在调节细胞凋亡信号中发挥重要作用。髓细胞白血病基因-1（myeloidcellleukemin-1，Mcl-1）属于Bcl-2家族独特的成员，由于Mcl-1半衰期短（1-4小时），对于各种刺激应答快，其表达在转录、转录后以及蛋白等水平受多种信号的严密调控，以及由于Mcl-1在肝癌等多种恶性肿瘤中普遍高表达，Mcl-1一直是肿瘤分子靶向治疗研究的热点。ABT-737、ABT-263(Navitoclax)是一种人工合成的小分子BH3模拟物，体内、外临床前期研究显示，ABT-737、ABT-263(Navitoclax)对多种类型的白血病和实体肿瘤（小细胞肺癌等）有很好的治疗作用，已经进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验。ABT-737、ABT-263(Navitoclax)同时作为小分子Bcl-2和Bcl-xL抑制剂，对Bcl-2、Bcl-xL具有高的亲和力，但对Mcl-1的亲和力极低。HCC和其它高表达Mcl-1的肿瘤细胞和组织对这个化合物诱导的凋亡抵制，这成为阻碍ABT-737、ABT-263(Navitoclax)进入临床应用的一个主要问题。有研究证明，联合其他化疗药物能有效增强肿瘤细胞对ABT-737、ABT-263(Navitoclax)治疗的敏感性。去甲斑蝥素（NCTD）是一个小分子抗肿瘤药物，它衍生于传统中药斑蝥。一些研究显示，NCTD的抗肿瘤作用可能和Bcl-2家族成员的作用相关。在前期研究中，我们注意到NCTD极大地抑制了Mcl-1在HCC细胞中的表达。阿斯匹林（乙酰水杨酸）是一种常见的非类固醇抗炎药物（NSAID)，它具有退热、镇痛和抗炎作用。和其它NSAIDs一样，阿斯匹林在多种肿瘤细胞中显示了强烈的抗癌作用。近期研究显示，阿斯匹林在结直肠癌、口腔鳞癌、宫颈癌和白血病细胞中的抗肿瘤作用和下调Mcl-1水平有关。然而，阿斯匹林能否抑制HCC细胞中Mcl-1的表达，是否能用来克服HCC细胞对Navitoclax的耐药没有被研究。本研究应用肝癌细胞株观察小分子BH3模拟物ABT-737和ABT-263(Navitoclax)对肝癌细胞的治疗作用及其和传统中药NCTD及阿斯匹林联合抗肿瘤效果，并研究其具体作用的分子机制。目的观察小分子BH3模拟物ABT-737、ABT-263(Navitoclax)单独和联合NCTD、阿斯匹林对HCC细胞的作用效果，研究2种小分子BH3模拟物单药、联合NCTD和阿斯匹林的抗癌活性及其作用的分子机制。方法分别应用4株、2株肝癌细胞株，SMMC-7721、BEL-7402、HepG2、Hep3B。采用MTT、克隆形成实验、台盼蓝拒染法、细胞转染、siRNA技术、qRT-PCR检测、流式细胞、westernblotting等方法，观察NCTD和阿斯匹林分别对2种小分子BH3模拟物ABT-737、ABT-263治疗肝癌的增强作用效果，并探讨具体分子机制。结果1.1NCTD抑制HCC细胞中Mcl-1的表达。用4种HCC细胞株HuH-7、HepG2、BEL-7402和SMMC-7721观察NCTD对Mcl-1表达的影响。15μMNCTD部分抑制了Mcl-1的表达，30、60μMNCTD完全抑制了Mcl-1在4株肝癌细胞中的表达。用NCTD治疗HCC细胞HuH-7、HepG2，细胞用蛋白酶抑制剂MG132预处理。结果显示，MG132处理导致两株细胞Mcl-1表达增加，MG132对NCTD介导的Mcl-1的下调有很小的作用，显示Mcl-1的下调不是依赖于蛋白酶依赖蛋白降解所致。30μMNCTD处理HuH-7和HepG2细胞6小时，提取RNA，RT-PCR检测发现，NCTD极大减少了Mcl-1mRNA水平。1.2阿斯匹林抑制肝癌细胞中Mcl-1的表达。2.5、5、10mM阿斯匹林处理HepG2和BEL-7402细胞，结果显示，阿斯匹林抑制了Mcl-1的表达。但2株肝癌细胞株中Bcl-2、Bcl-xL、XIAP和Survivin的表达没有变化。5mM阿斯匹林作用于细胞48h，部分抑制了Mcl-1的表达，10mM阿斯匹林完全抑制了Mcl-1的表达。2.1NCTD增强了ABT-737介导的肝癌细胞的增殖抑制和诱导的凋亡。MTT检测NCTD对ABT-737诱导的HCC细胞增殖抑制作用。实验结果显示，HuH-7和HepG2细胞对ABT-737不敏感。但是，在NCTD联合1-3μMABT-737极大地抑制了4株肝癌细胞的增殖。在HuH-7和HepG2细胞中，NCTD或ABT-737单药处理细胞48小时对诱导细胞凋亡的作用很小。联合处理细胞则引起了2株细胞中大量的细胞凋亡。2.2阿斯匹林增强Navitoclax介导的肝癌细胞增殖抑制。阿斯匹林、Navitoclax单药或2种药物联合作用于肝癌细胞48小时，MTT检测细胞的存活抑制率。阿斯匹林或Navitoclax单药对2株HCC细胞有很小的杀伤作用。联合用药后极大地抑制了2株HCC细胞的增殖。实验中发现联合用药的效果和阿斯匹林抑制Mcl-1的作用密切相关。5、10mM阿斯匹林几乎完全抑制了Mcl-1的表达，5、10mM阿斯匹林和Navitoclax联合对肝癌细胞的增殖抑制率为80-100%。阿斯匹林主要通过下调Mcl-1，增强了Navitoclax对肝癌细胞的增殖抑制作用。3.1NCTD增强了ABT-737触发的PARP切割和caspases激活。westernblotting结果显示，ABT-737和NCTD联合处理细胞48h，导致了PARP蛋白的切割，单药对PARP的表达影响很小。caspase-9活化片段（37/35kd）在2株HCC细胞中明显增加。ABT-737和NCTD联合处理细胞后极大增加了caspase-3的水解片段（19/17kd）。用50μM泛caspase抑制剂（zVAD.fmk）预处理HuH-7和HepG2细胞1小时，然后加入30μMNCTD和3μMABT-737。抑制caspase活性显著降低了联合用药诱导的细胞死亡，显示两药联合的抗癌活性依赖于caspases通路。3.2阿斯匹林增强Navitoclax介导的抗癌活性主要通过诱导肝癌细胞的凋亡，诱导了PARP的切割和caspase-9、-3的激活。5mM阿斯匹林、Navitoclax单药或它们的联合作用肝癌细胞48小时。膜联蛋白-V/碘化丙啶（Annexin-V/PI)双染，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示，阿斯匹林或Navitoclax单药对2株HCC细胞诱导细胞凋亡的作用很小，联合用药处理BEL-7402、HepG2细胞分别诱导了89%、81%的细胞凋亡。westernblotting检测显示，两个单药处理细胞后对PARP切割和Caspase-9、-3激活几乎没有影响，但两药联合处理细胞后，极大诱导了PARP切割和Caspase-9、-3激活。4.1NCTD增强了ABT-737触发的细胞色素C的释放。细胞色素C从线粒体内释放进入胞浆是Bcl-2家族蛋白调节细胞凋亡的一个主要事件。对照组和ABT-737单药处理的细胞胞浆中没有检测到细胞色素C，NCTD处理后胞浆中细胞色素C也成低水平，但联合用药后细胞色素C显著增加。4.2阿斯匹林通过线粒体凋亡信号通路增强了Navitoclax介导的抗癌活性。阿斯匹林和Navitoclax单药处理细胞后，胞浆中没有检测到从线粒体释放的细胞色素C。两药联合处理细胞后，检测到了细胞色素C的表达，提示联合用药后激活了线粒体凋亡信号通路。实验中应用Caspase-9的抑制剂Z-LEHD-FMK，探讨两药联合抗肿瘤作用是否依赖于线粒体介导的细胞凋亡诱导。用Caspase-9的抑制剂预处理HCC细胞1小时，然后加入5mM阿斯匹林和1μMNavitoclax。结果发现Z-LEHD-FMK几乎完全抑制了联合用药诱导的HCC细胞死亡。5.1下调Mcl-1增强了HCC细胞对ABT-737治疗的敏感性。用siRNA技术下调Mcl-1，westernblotting检测显示下调Mcl-1显著增强了ABT-737触发的PARP切割和Caspase-3激活。下调细胞中Mcl-1的表达增强了ABT-737诱导HCC细胞的死亡作用。5.2通过siRNA下调Mcl-1模拟阿斯匹林在HCC细胞中对增强Navitoclax介导的抗肝癌中的作用。用siRNA下调Mcl-1，Navitoclax单独作用于2株肝癌细胞株获得了和5mM阿斯匹林联合用药后类似的抗肝癌效果。6Bax和Bak在NCTD增强ABT-737诱导的HCC细胞凋亡中发挥了必不可少的作用。用siRNA技术下调Bax和Bak并且检测抑制Bax/Bak后，对于两药联合处理HuH-7和HepG2细胞对PARP切割和诱导细胞死亡的影响。结果显示，下调细胞中Bax/Bak的表达，显著减少了ABT-737和NCTD联合处理HCC细胞后PARP蛋白的切割和诱导的细胞死亡。结论NCTD和阿斯匹林能提高肝癌细胞对小分子BH3模拟物治疗的敏感性，这种抗肝癌作用主要是NCTD和阿斯匹林通过下调Mcl-1的表达，疏通了BH3模拟物诱导肝癌细胞凋亡的信号通路实现。肝癌的恶性生物学行为如，局部侵袭、远处转移以及手术后复发和抗药性等与凋亡抑制家族蛋白(InhibitorofApoptosisProteins，IAPs)在肝癌的过度表达引起癌细胞凋亡失衡关系密切。IAPs在HCC中的过度表达导致了HCC对化疗的抵抗和高复发率。IAPs的凋亡抑制功能可被一种称为第二个线粒体衍生的半胱氨酸天冬氨酸水解酶（caspase)激活剂（secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase，Smac）的线粒体蛋白质拮抗，小分子Smac模拟物通过以IAPs为靶点诱导肿瘤细胞的凋亡，进而发挥其抗肿瘤的作用。根据Smac蛋白质的功能结构研制的抗癌新药小分子Smac模拟物已经进入临床研究。小分子Smac模拟物可通过特异性地拮抗IAPs在多种恶性肿瘤的过度表达，显著地增进这些肿瘤对化疗药物的敏感性。目前，有关小分子Smac模拟物介导肝癌化疗增敏作用的研究尚未见报道。本研究应用肝癌细胞株、原代培养的肝癌细胞评价小分子Smac模拟物SM-164对肝癌的治疗及其对APO2L/TRAIL和阿霉素抗肿瘤的增敏作用，应用流式细胞学、siRNA技术、westernblotting等实验技术探讨药物对凋亡通路相关蛋白影响，研究其抗肝癌作用的具体分子机制。目的观察IAPs抑制剂Smac模拟物单独和联合化疗药物对HCC的抗肿瘤效果，探讨Smac模拟物的抗肿瘤活性及其对化疗药物增敏的分子机制。方法4株肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402、HepG2、Hep3B和1株正常的肝细胞株L02，收集12例HCC手术病人切除的新鲜肝癌组织并进行原代培养的细胞用在本研究中。其中12例HCC患者中男9例，女3例。年龄32-72岁，平均年龄48.9岁。采用MTT、台盼蓝拒染法、流式细胞、westernblotting等方法，观察小分子Smac模拟物SM-164对肝癌化疗的增敏效果，并研究其分子机制。HCC细胞经过Smac模拟物SM-164处理后，MTT检测细胞存活率、台盼蓝拒染法检测诱导的细胞死亡、克隆形成实验等方法用于评估抗癌活性；Westernblotting检测和广谱的caspases抑制剂（zVAD-fmk）用于探讨具体的分子机制。结果1SM-164单独作用于4株HCC细胞，诱导HCC细胞中cIAP-1的迅速降解，但对HCC细胞有很小的杀伤作用。Westernblotting检测0.1μMSM-164处理HCC细胞株BEL-7402、SMMC-7721、HepG2和Hep3B后cIAP-1和XIAP表达水平的变化。结果显示，0.1μMSM-164作用于HCC细胞1h后cIAP-1的表达减少，但是SM-164作用于这些HCC细胞24h后检测，XIAP表达没有变化。SM-164处理这4株HCC细胞4天，细胞存活率仅有很小或没有变化。Hep3B是对SM-164最敏感的的细胞株，其IC50是21μM。HepG2最耐受，100μMSM-164细胞存活抑制率小于50%。此外，SM-164对BEL-7402、SMMC-7721作用的IC50分别是45和63μM。2SM-164能增强APO2L/TRAIL的抗HCC活性。MTT法检测BEL-7402、SMMC-7721、HepG2和Hep3B4株HCC细胞株细胞对APO2L/TRAIL作为单药的敏感程度。结果显示，BEL-7402细胞株细胞对APO2L/TRAIL敏感。10、30、100ng/mlAPO2L/TRAIL处理细胞4天，细胞的存活抑制率分别是27%、54%和74%。SMMC-7721、HepG2和Hep3B3株细胞对APO2L/TRAIL耐受。用1000ng/mlAPO2L/TRAIL处理3株细胞株细胞4天，对细胞的抑制率<10%。APO2L/TRAIL和SM-164联合作用于HCC细胞的结果显示，在BEL-7402细胞，0.1μMSM-164显著增强了由APO2L/TRAIL介导的细胞存活抑制作用（p<0.05）。SM-164也极大提高了在对APO2L/TRAIL治疗耐受的HCC细胞SMMC-7721、HepG2和Hep3B的抗癌活性。在SMMC-7721细胞株中，1000ng/mlAPO2L/TRAIL单药对细胞几乎没有杀伤作用，100、300ng/mlAPO2L/TRAIL和SM-164联合之后对细胞的生存抑制率分别是80%和100%。3SM-164增强了APO2L/TRAIL介导的肝癌细胞的集落形成能力的抑制。集落形成实验检测SM-164和APO2L/TRAIL的联合作用对HCC细胞是否有长期的效果。SM-164和APO2L/TRAIL的联合处理对APO2L/TRAIL治疗耐受的SMMC-7721和HepG2细胞株2周后观察。在SMMC-7721细胞，细胞对SM-164和APO2L/TRAIL单药的治疗效果不明显，但是联合用药处理后，细胞的集落形成能力完全抑制（p<0.001）。此外，在HepG2细胞中，尽管SM-164和APO2L/TRAIL联合联合处理后对细胞存活抑制率和凋亡率作用很小，但是在集落形成实验中，相对于单药，相同浓度的药物联合处理细胞后极大地抑制了细胞集落形成能力（p<0.001）。4SM-164没有增强APO2L/TRAIL对人正常肝细胞的细胞毒性。用人肝细胞L02细胞株检测SM-164是否能增强APO2L/TRAIL对人正常肝细胞的毒性作用。结果显示，用300和3000ng/mlAPO2L/TRAIL处理L02细胞4天，细胞的存活抑制率分别是7%和23%。0.1μMSM-164和APO2L/TRAIL联合处理细胞后，也没有增强APO2L/TRAIL介导的细胞存活抑制作用。5SM-164增强了APO2L/TRAIL诱导的HCC细胞株细胞的凋亡。SM-164和APO2L/TRAIL单药或联合处理SMMC-7721细胞后，用Annexin-V染色和流式细胞学检测细胞的凋亡率。相对于对照组，SM-164、APO2L/TRAIL联合处理24h细胞凋亡率分别是7%和14%。但是两药联合处理细胞后凋亡率是77%。Westernblotting结果显示，SM-164显著增强了APO2L/TRAIL触发的凋亡信号通路上的主要蛋白caspase-8、caspase-3和激活状态PARP的累积。但是泛Caspases抑制剂z-VAD-fmk能减弱SM-164和APO2L/TRAIL这种联合作用。6SM-164和APO2L/TRAIL联合后抑制了AKT在HCC细胞中的活性。SM-164、APO2L/TRAIL单药或联合处理SMMC-7721、BEL-7402、HepG2细胞，westernblotting检测AKT蛋白的表达。结果显示，AKT蛋白在所有3株HCC细胞株中被激活。APO2L/TRAIL单药没有明显抑制AKT的激活，APO2L/TRAIL联合SM-164显著减少了AKT的磷酸化水平。7SM-164增强了APO2L/TRAIL诱导的原代HCC细胞的死亡。原代HCC细胞从12个HCC外科手术病人的切除的新鲜标本获取，分离、培养。用0.1μMSM-164、100ng/mlAPO2L/TRAIL单药和两药联合处理细胞24h，台盼蓝拒染法检测细胞死亡率。SM-164单药作用12个HCC细胞中，只诱导了2个原代HCC细胞明显的细胞死亡（NO.9和NO.12）。但SM-164和APO2L/TRAIL联合用药后诱导了12种细胞中的11个原代培养细胞死亡。从7个病人标本培养的原代细胞显示了统计学差异（p<0.05）。SM-164+APO2L/TRAIL对原代HCC细胞的死亡诱导作用使PARP蛋白激活，SM-164增强原代培养的HCC细胞对APO2L/TRAIL敏感和疾病的发展阶段没有关系。8SM-164增强了阿霉素对HCC细胞的抗癌活性。实验中同时观察了SM-164是否能够增强临床上常用的化疗药物阿霉素对HCC细胞的治疗作用。1μM阿霉素（Dox）、0.1μMSM-164分别单药和Dox+SM-164联合处理细胞48h，研究发现，Hep3B细胞株对Dox单药治疗最敏感，用1μM阿霉素作用细胞48h后导致了41%的细胞死亡。10μM阿霉素分别诱导SMMC-7721、BEL-740232%、31%细胞死亡。实验中同时发现，0.1μMSM-164显著增强了所有3株HCC细胞株由阿霉素诱导的细胞死亡。westernblotting分析结果显示，SM-164+阿霉素处理3株HCC细胞后，激活状态的caspase-3和PARP蛋白表达增加。9SM-164联合阿霉素抑制了HCC细胞中AKT的激活。在Hep3BHCC细胞株中用1μM阿霉素，在BEL-7402、SMMC-7721细胞用10μM阿霉素单药、0.1μMSM-164单药或/和两者联合处理细胞24h，westernblotting检测AKT水平。SM-164、阿霉素单药作用于HCC细胞对AKT磷酸化没有或是作用很小。但是SM-164+阿霉素联合治疗组的HCC细胞中AKT的磷酸化水平明显降低。结论IAPs抑制剂能有效增强APO2L/TRAIL和阿霉素抗HCC效果，这种治疗作用主要是增强了APO2L/TRAIL和阿霉素诱导HCC细胞的凋亡信号和抑制生存信号。本研究同时也提示作为IAPs抑制剂的Smac模拟物是一种新的对HCC有良好治疗效果的药物。
【作者】李功权；
【导师】张水军；
【作者基本信息】郑州大学，普通外科，2014，博士
【关键词】髓细胞白血病基因-1；Bcl-2抑制剂；肝癌；凋亡；凋亡抑制蛋白；Smac模拟物；化疗；

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