Peroxiredoxin1在鞭毛/纤毛解聚及食管癌发生发展中的作用

【摘要】食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中其死亡率排在第六位。食管癌主要有两种组织学类型：食管鳞状细胞癌和腺癌。在西方国家食管癌主要是以腺癌为主，我国及其它亚洲国家主要是食管鳞癌。虽然在基础研究和临床方面对食管鳞癌都进行了大量工作，但是食管鳞癌的预后仍然没有得到较大改善，病人术后的五年生存率也只有10~20%。总的来说，其预后很差的主要原因是目前尚缺乏有效的早期诊断的标志物和治疗靶点，而且其发生发展的分子机制仍不清楚。鞭毛(flagellum)/纤毛(cilium)是在进化上非常保守的细胞器，能够接受来自外界环境或者其他细胞的物理、化学信号，并将这些信号传递到细胞核进而引发细胞反应，例如，初级纤毛（primarycilia，本文简称为纤毛）在许多肿瘤发生发展过程中起关键作用的一些信号转导途径如PDGFαα、Hedgehog和mTOR中发挥重要功能。此外，越来越多的实验证实，与正常的组织相比，在许多肿瘤中，如肾癌、乳腺癌、恶性胶质瘤和胰腺癌等肿瘤中纤毛发生了丢失。虽然我们目前知道纤毛可能在肿瘤发生发展中发挥重要功能，但是对纤毛丢失（解聚）和组装的机制尚没有清晰认识。虽然几乎人类所有类型的细胞都有纤毛存在，但是直接以人的纤毛作为研究对象是非常困难的，其原因在于纤毛长度很短，而且在肿瘤发生过程中纤毛也发生了解聚或丢失，所以目前有关纤毛的知识大部分是来自于对模式生物的研究。低等真核生物的细胞表面也存在鞭毛，而且其基因组结构相对简单有利于对鞭毛进行研究。例如，鞭毛内运输机制最早就是在莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii,C.reinhardtii）中发现的，随后的研究也证实在高等生物的纤毛中也存在同样的机制。目前已经有一些鞭毛/纤毛相关基因在模式生物中被克隆出来，并对其功能做了一定的研究。目前常用的模式生物主要由莱茵衣藻、线虫（Caenorhabditiselegans）、果蝇（Drosophilamelanogaster）和斑马鱼（zebrafish）等。Peroxiredoxin1（Prdx1）最早是作为增强自然杀伤细胞活性的因子和细胞内氧自由基“清道夫”被鉴定出来的。后来发现Prdx1在H2O2介导的信号转导中发挥重要功能。最近研究表明Prdx1在肿瘤发生发展中的功能尚存争议。Prdx1曾经被认为是抑癌基因，主要原因是其能够结合并抑制两个主要的癌蛋白c-Abl和c-Myc的表达，另外Prdx1抑制肿瘤发生是通过保护抑癌基因PTEN免受氧化作用诱导失活。但是，越来越多的证据显示，Prdx1在肿瘤发生过程中发挥重要功能，主要是其在许多肿瘤发生过程中高表达或表达上调，如在肺癌、结肠癌、口腔癌和食管鳞癌，并被视为是肿瘤的一个潜在癌症诊断的标志物和治疗靶点。重要的是，人类纤毛、杜氏盐藻（Dunaliellasalina,D.salina）鞭毛和莱茵衣藻鞭毛的蛋白质组中也发现有Prdx1蛋白的肽段存在，但是其是否定位在鞭毛/纤毛上，以及在鞭毛调控中发挥什么样的功能还有待探索。本研究以从杜氏盐藻鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交（suppressionsubtractivehybridization，SSH）cDNA文库中筛选出来的Prdx1基因为研究对象，结果显示，进化高度保守的Prdx1基因定位在杜氏盐藻的鞭毛和基体上，并与鞭毛的解聚有关。人源的Prdx1基因在食管鳞癌细胞中高表达，并且纤毛在食管鳞癌细胞中丢失，抑制Prdx1的表达能够降低癌细胞的增殖和侵袭能力，促进细胞的凋亡和纤毛发生，LKB1-AMPK-mTOR信号途径的活性被下调。我们的结果表明，异常表达的纤毛相关基因包括Prdx1既影响纤毛发生又影响癌症发生，并且Prdx1是一个潜在的食管鳞癌治疗的分子靶点。第一部分：杜氏盐藻Prdx1在鞭毛/纤毛解聚中的作用目的：以杜氏盐藻鞭毛为模式细胞器研究纤毛解聚在食管鳞癌发生发展中的作用，通过构建杜氏盐藻鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交cDNA文库，筛选鞭毛解聚过程中的差异基因，并初步研究其是否参与鞭毛解聚过程，为研究纤毛解聚在食管鳞癌中的功能奠定基础。方法：第一章杜氏盐藻鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交cDNA文库的构建1.利用IBMX诱导杜氏盐藻鞭毛解聚，检测鞭毛长度变化情况；2.提取野生型和IBMX诱导鞭毛解聚30min后的杜氏盐藻细胞总RNA，利用PCR-SelectTMcDNASubtractionkit构建鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交cNDA文库，通过测序和BLAST比对筛选出差异表达基因即鞭毛解聚相关基因。第二章杜氏盐藻DsPrdx1基因cDNA的克隆、原核表达1.根据文库筛选基因测序结果，设计引物，利用RACE的方法分别克隆获得杜氏盐藻Prdx1（DsPrdx1）基因的5’和3’cDNA末端片段，将上述片段拼接得到DsPrdx1基因的cDNA全长，然后设计PCR引物，克隆DsPrdx1cDNA全长，测序后进行生物信息学分析；2.在两端添加了酶切位点的杜氏盐藻Prdx1cDNA编码序列定向克隆到载体pET28a(+)上，构建pET28a-Prdx1原核表达重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG诱导DsPrdx1蛋白表达，然后利用Ni-IDA-SefinoseKit纯化融合蛋白。第三章DsPrdx1的多克隆抗体制备及功能分析1.将纯化后的DsPrdx1蛋白与弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射免疫新西兰白兔，每只兔子免疫5次，末次免疫7天后颈动脉取血，利用间接ELISA法检测抗血清滴度；2.利用Westernblotting和间接免疫荧光法检测DsPrdx1在杜氏盐藻细胞中的定位；3.通过Westernblotting的方法检测DsPrdx1在杜氏盐藻鞭毛解聚过程中的蛋白表达水平变化情况。结果：第一章杜氏盐藻鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交cDNA文库的构建1.利用IBMX诱导杜氏盐藻鞭毛解聚，结果显示，在IBMX加入后能够在30min内使杜氏盐藻鞭毛发生解聚，鞭毛长度由~11.5μm缩短为~7.5μm；2.提取野生型和IBMX诱导鞭毛解聚30min后的杜氏盐藻细胞总RNA，利用PCR-SelectTMcDNASubtractionkit构建鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交cNDA文库，通过测序和BLAST比对筛选出来的差异表达基因，其中能够与其他物种BLAST比对出相应基因的EST序列有6个，还有6个未知的EST序列。第二章杜氏盐藻Prdx1基因cDNA的克隆、原核表达1.利用文库测序获得的372bp长的DsPrdx1基因cDNA片段设计引物，然后通过RACE的方法分别获得了541bp和843bp的PCR片段，除去重叠碱基序列后获得的DsPrdx1的全长为956bp，此序列中包含一个长度为606bp的开放阅读框，该开放阅读框对应201个氨基酸序列长度，经BLAST分析后显示其与其他物种的Prdx1具有高度的同源性；2.杜氏盐藻Prdx1cDNA编码序列定向克隆入原核表达载体pET28a(+)，测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后成功表达融合蛋白DsPrdx1，利用Ni-IDA-SefinoseKit纯化融合蛋白，为下一步制备多克隆抗体做准备。第三章杜氏盐藻Prdx1的多克隆抗体制备及功能分析1.间接ELISA检测结果显示，制备的兔抗DsPrdx1多克隆抗体的效价达到1:256K~1:512K之间；2.Westernblotting和免疫荧光结果显示，DsPrdx1定位在杜氏盐藻的鞭毛和基体上；3.Westernblotting结果显示，在IBMX诱导杜氏盐藻鞭毛解聚的过程中，Prdx1的表达显著升高。结论：在杜氏盐藻鞭毛解聚相关基因抑制消减杂交cDNA文库中筛选得到的DsPrdx1基因在进化中高度保守，其定位在杜氏盐藻的鞭毛和基体上，并在鞭毛解聚过程中表达显著升高，说明Prdx1确实与鞭毛/纤毛的解聚有关。第二部分：Prdx1在食管鳞癌发生发展中的功能目的：研究Prdx1在食管鳞癌细胞中的表达情况及在食管鳞癌发生发展中作用，鉴于前面的实验结果，观察人源Prdx1能否对食管鳞癌细胞的纤毛有影响，并初步探索其对肿瘤和纤毛调控的分子机制。方法：第一章食管鳞癌细胞中Prdx1表达情况及纤毛检测1.通过Westernblotting的方法检测正常食管上皮细胞Het-1A细胞和食管鳞癌细胞株EC9706、Eca109、EC1及阳性对照细胞HeLa229细胞中Prdx1蛋白的表达情况；2.通过免疫荧光的方法检测正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中纤毛化的细胞比例。第二章Prdx1对纤毛和食管鳞癌调控作用的初步探索1.构建shRNA慢病毒干扰食管鳞癌细胞中Prdx1的表达，检测其对食管鳞癌细胞增殖、周期分布、侵袭能力和凋亡的影响；2.检测食管鳞癌细胞在Prdx1表达抑制后，细胞的纤毛表达情况和纤毛标志蛋白AuroraA的活性情况；3.检测食管鳞癌细胞在Prdx1表达抑制后，LKB1-AMPK途径的活性情况；4.检测食管鳞癌细胞在Prdx1表达抑制后，mTOR/p70S6K途径的活性情况。结果：第一章食管鳞癌细胞中Prdx1表达情况及纤毛检测1.Westernblotting结果显示，Prdx1在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中都有表达，与Het-1A细胞相比，EC9706、Eca109和EC1细胞中Prdx1的表达分别升高~5.9倍（P<0.001）、~3.8倍（P<0.01）和~3.3倍（P<0.01）；2.免疫荧光检测结果显示，在血清饥饿诱导纤毛再生24h后，与Het-1A细胞相比，EC9706和Eca109细胞中纤毛化的细胞数量显著减少：Het-1A、EC9706和Eca109纤毛化的细胞比例分别为：39.95%（n=431）、12.52%（n=576,P<0.05）和14.27%（n=496,P<0.05）。第二章Prdx1对纤毛和食管鳞癌调控作用的初步探索1.构建的shRNA慢病毒能够使Prdx1的表达下降~2.2倍（P<0.05），当Prdx1表达被抑制后，EC9706细胞的增殖率由~37.87%下降为~25.83%（P<0.05）；transwell小室显示Prdx1沉默的EC9706对照组侵袭细胞个数平均为24.5±3.7个，而EC9706实验组侵袭细胞平均个数下降为9.4±4.7个（P<0.05）；Prdx1沉默的EC9706细胞的凋亡比例为8.03%，比对照EC9706细胞增加了~3.1倍（P<0.05），并且Caspase-3蛋白的表达量升高了0.62倍（P<0.05）；但是Prdx1沉默对EC9706细胞的周期分布没有影响；2.当沉默Prdx1表达，EC9706和Eca109细胞的纤毛发生被部分恢复，EC9706纤毛化的细胞比例从11.11%增加到24.73%（n=454,P<0.05）Eca109纤毛化的细胞比例从11.32%增加到25.67%（n=447,P<0.05），并且纤毛解聚标志蛋白AuroraA的活性蛋白在EC9706细胞和Eca109细胞中分别表达降低了~1.79倍（P<0.05）和~1.36倍（P<0.05）；3.当沉默Prdx1表达，EC9706细胞中的LKB1和p-AMPK的表达显著升高，分别上升了~1.12倍（P<0.05）和~1.13倍（P<0.05）；Eca109细胞中LKB1和p-AMPK表达也显著升高，分别升高了~2.01倍（P<0.05）和4.22倍（P<0.05）；4.当沉默Prdx1表达，EC9706细胞中mTOR和p70S6K总蛋白的表达分别下降了~1.5倍（P<0.001）和~3.48倍（P<0.001），他们相应的活性蛋白也分别下降了~1.2倍（P<0.001）和~3.3倍（P<0.05）。结论：高度保守的Prdx1基因在食管鳞癌细胞中高表达，当其在食管鳞癌细胞中被shRNA慢病毒干扰后，癌细胞的增殖和侵袭能力被抑制，细胞凋亡被诱导，并且纤毛发生被部分恢复，但细胞的周期分布不受影响，Prdx1对纤毛和食管鳞癌发生的调控可能是通过LKB1-AMPK-mTOR途径来实现的。
【作者】龚方华；
【导师】薛乐勋；张明智；
【作者基本信息】郑州大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】食管鳞癌；杜氏盐藻；鞭毛/纤毛解聚；Peroxiredoxin1；

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