食管鳞癌中miR-451和miR-21表达及对生长、侵袭和凋亡的影响

【摘要】背景和目的：食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发生以鳞癌为主。尽管现在我国对食管鳞癌的诊断及治疗水平有很大提高，但食管鳞癌由于早期的侵袭转移使其临床进展迅速预后较差，尤其是河南省林州市，是著名的食管癌高发区。由于大多数患者就诊时已属中晚期，不能手术，且放化疗并未能明显延长患者的生存期，因此从分子水平探讨食管癌发生发展，为从基因水平上防治该病具有重要的现实意义和理论价值。非蛋白质编码微小RNA(microRNA,miRNA)是具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸，广泛存在于真核生物中并能通过与靶标基因mRNA上的3’UTR区特异结合来调节靶标基因的翻译或者保持其稳定性。研究发现miRNA参与了调控细胞增殖和凋亡，在肿瘤的发生发展过程中扮演了重要的角色，类似于抑癌基因和癌基因的功能。越来越多的miRNA被发现在多种恶性肿瘤中异常表达，包括白血病、大肠癌、肺癌、乳腺癌、脑癌及前列腺癌等。其中miR-451和miR-21是消化道肿瘤的研究热点。miR-451位于染色体17qll.2，参与调控了多种生理及病理过程，如：造血系统分化、上皮细胞极性的形成、胚胎成熟、神经系统发育、肿瘤形成及心血管疾病的发生。研究发现miR-451在多种肿瘤组织中表达异常，并且参与了某些肿瘤的生物学行为和耐药基因的调控。miR-21属单基因编码，其编码基因位于17q23，长度为22个核苷酸，参与了细胞的增殖、分化和凋亡，研究发现miR-21与大多数的肿瘤有关。通过对肿瘤组织或癌细胞株中miRNA表达谱的研究发现，miR-21在肝细胞癌、结肠癌、胃癌、胆管癌、乳腺癌、肺癌、B细胞淋巴瘤等多种肿瘤中比癌旁正常组织表达明显增高，证实其在肿瘤形成过程中具有促进癌细胞浸润和转移的功能。然而miR-451和miR-21在食管鳞癌中的表达及对生长、侵袭和凋亡的影响、调控的分子机制仍然不是很清楚。鉴于此，本课题拟首先研究miR-451和miR-21在食管鳞癌中的表达，然后观察调控miR-451和miR-21表达对食管鳞癌细胞EC-9706生长、侵袭和凋亡的影响，并初步探讨miR-451和miR-21影响细胞生长、侵袭和凋亡的分子机制。本课题包括以下三部分：第一部分：食管鳞状细胞癌组织中miRNA异常表达及与临床病理特征相关性分析；第二部分：体内外调控miR-451和miR-21表达对食管鳞癌细胞系EC9706生长、侵袭和凋亡的影响；第三部分：miR-451和miR-21靶基因及肿瘤抑制作用机制的初步研究。第一部分食管鳞状细胞癌组织中miRNA异常表达及与临床病理特征相关性分析方法：1.收集标本，包括53例食管鳞状上皮细胞癌组织与53例配对的癌旁组织标本。2.运用AgilentmiRNA芯片检测3例食管鳞状上皮细胞癌组织与配对的癌旁组织标本中miRNA表达情况，并对差异表达基因进行初步功能分析。3.运用qRT-PCR检测53例标本中12种miRNA表达情况水平，包括3个食管癌中表达上调的miRNA(miR-21,miR-125a-3pandmiR-503)和9个食管癌中表达下调的miRNA基因(miR-429,miR-133b,miR-451,miR-139-5p,miR-133a,miR-127-3p,miR-210,miR-199a-5pandmiR-199b-5p)。4.依据miR-21和miR-451表达水平，运用双变量相关性分析其与食管癌病人性别、年龄、肿瘤分化、TNM分期及有无淋巴结转移之间的相关性。5.统计学分析：所有实验数据均使用SPSSl7.0统计软件包，多项指标间采用单因素方差分析，两指标间进一步比较采用LSD-t检验；计量资料采用t检验；差异性分析用配对χ2检验；相关性检验用Spearman相关分析，以α=0.05为显著性水准。结果：1.AgilentmiRNA芯片检测分析得到199个差异表达的miRNA基因,其中有103个（52%）差异表达基因为上调miRNA基因，96个（48%）基因为下调miRNA基因。miR-451在食管鳞癌组织中低表达，miR-21在食管鳞癌组织中高表达。2.qRT-PCR结果显示在12种miRNA中只有miR-503验证结果和基因芯片结果不一致，其余11种miRNA两种方法（Agilent基因芯片和qRT-PCR）得到的结果具有很好的一致性，证实了芯片数据的可靠性。3.通过双变量相关性分析发现食管癌组织中miR-451和miR-21的表达水平与有无淋巴结转移、食管癌分化程度及TNM分期相关(P<0.05)，与病人的年龄、性别和肿瘤部位无相关性(P>0.05)。第二部分体内外调控miR-451和miR-21表达对食管鳞癌细胞系EC9706生长、侵袭和凋亡的影响方法：1.分别合成miR-451mimics、miR-21inhibitor和miRNAscramble，选用对数生长期EC9706按照实验分组分别使用LipofectamineTM2000进行脂质体转染。2.运用荧光定量RT-PCR和Western-blot检测各实验组细胞中肿瘤生长、转移和凋亡相关基因Bcl-2、AKT、CDKN2D、FasL和TIMP3mRNA和蛋白水平表达。3.Transwell侵袭实验法检测EC-9706细胞的侵袭转移能力。4.CCK-8试剂盒检测EC-9706细胞增殖和生长能力。5.流式细胞仪检测EC-9706细胞周期变化和细胞凋亡情况。6.裸鼠移植瘤实验检测体内水平调控miR-451和miR-21表达对食管癌的影响。7.统计学分析：利用SPSS17.0软件,计量资料采用t检验；RealTimePCR结果及肿瘤质量组间比较采用方差分析。以P<0.05做为有统计学意义。结果：1.miR-451mimics组的miR-451的相对表达量是15.84±3.07，对比空白对照组，表达水平显著上调（P<0.01）；miR-21inhibitor组的miR-21的相对表达量是0.14±0.02，对比空白对照组，表达水平显著下调（P<0.01）。2.miR-451mimics组细胞Bcl-2、AKT和CDKN2D表达均显著下调(P<0.05)；miR-21inhibitor组的FasL和TIMP3表达水平显著上调（P<0.01）。3.miR-451mimics组平均侵袭细胞数为47.4±7.4，与对照组比较显著降低(P<0.01)。miR-21inhibitor组的平均侵袭细胞数为24.1±3.1，与对照组比较显著降低(P<0.01)。4.miR-451mimics组和miR-21inhibitor组细胞的生长在转染2d后出现显著抑制（P<0.05），并且随时间的延长而日益显著。5.miR-451mimics组G0/G1细胞比例增加至74.89%，S细胞比例显著降低至15.84%，G2/M期细胞比例显著降低至9.27%，与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）。6.miR-451组细胞凋亡率为(12.07±1.12)%，与对照组比较显著升高(P<0.01)；miR-21inhibitor组细胞凋亡率为(12.89±1.28)%，与对照组比较显著升高(P<0.01)。7.miR-451mimics组肿瘤体积为616.41士49.52mm3，显著低于对照组肿瘤体积(P<0.01)；miR-21inhibitor组肿瘤体积394.36士31.41mm3，显著低于对照组肿瘤体积(P<0.01)。第三部分miR-451和miR-21靶基因及肿瘤抑制作用机制的初步研究方法：1.通过生物信息学分析推测miR-451和miR-21的靶基因。2.构建野生和突变型重组载体pmirGLO-CDKN2D、pmirGLO-TIMP3和pmirGLO-FASL,采用Westernblot和双荧光素酶报告实验验证miR-451和miR-21的靶基因。3.构建缺3’UTR的表达载体pcDNA3.1-CDKN2D、pcDNA3.1-TIMP3和pcDNA3.1-FASL,通过restore方法分析CDKN2D、TIMP3和FASL对EC9706细胞周期、侵袭和凋亡的影响。结果：1.通过生物信息学分析推测TIMP3及FASL为miR-21靶基因，CDKN2D为miR-451靶基因。2.食管鳞癌细胞EC9706中，共转染miR-451mimics和野生型3’UTR区的pmirGLO-CDKN2D重组载体时，细胞的萤光素酶活性显著受到抑制（P<0.05）,提示miR-451可以通过作用于CDKN2D的3’UTR区，负向调控其表达。3.食管鳞癌细胞EC9706中，共转染miR-21mimics和野生型3’UTR区的pmirGLO-TIMP3重组载体时，细胞的萤光素酶活性显著受到抑制（P<0.05）;共转染miR-21inhibitor和野生型3’UTR区的pmirGLO-TIMP3重组载体时，细胞的萤光素酶活性显著升高（P<0.05）。提示miR-21可以通过作用于TIMP3的3’UTR区，负向调控其表达。4.食管鳞癌细胞EC9706中，共转染miR-21mimics和野生型3’UTR区的pmirGLO–FASL重组载体时，细胞的萤光素酶活性明显受到抑制（P<0.05）;共转染miR-21inhibitor和野生型3’UTR区的pmirGLO-FASL重组载体时，细胞的萤光素酶活性显著升高（P<0.05）,提示miR-21可以通过作用于FASL的3’UTR区，负向调控其表达。5.细胞周期实验结果显示：仅转入无3’UTR区的pcDNA3.1-CDKN2D表达载体时G0/G1细胞比例数较Scramble对照组明显降低，S期细胞比例显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；共转染miR-451mimics和pcDNA3.1-CDKN2D表达载体时，S期和G0/G1细胞比例数对比仅转入无3’UTR区的pcDNA3.1-CDKN2D表达载体时细胞S期和G0/G1细胞比例数无显著改变，差异无统计学意义（P>0.05）。6.细胞侵袭实验结果显示：仅转入无3’UTR区的pcDNA3.1-TIMP3表达载体时的穿过基底膜的细胞数较Scramble空白对照组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；共转染miR-21mimics和无3’UTR区的pcDNA3.1-TIMP3表达载体时，穿过基底膜的细胞数对比仅转入无3’UTR区的pcDNA3.1-TIMP3表达载体时穿过基底膜的细胞数无显著性改变（P>0.05）。7.凋亡检测实验结果显示：仅转入无3’UTR区的pcDNA3.1-FASL表达载体时，食管癌细胞EC9706的细胞凋亡数较Scramble空白对照组显著增高（P<0.05，）；共转染miR-21mimics和pcDNA3.1-FASL表达载体时，细胞凋亡数对比仅转入pcDNA3.1-FASL表达载体时的细胞凋亡数没有显著性差异（P>0.05）。结论：1.本研究在食管癌组织中一共筛选分析得到199个差异表达的miRNA基因,其中有103个（52%）差异表达基因为上调miRNA基因，96个（48%）基因为下调miRNA基因。miR-451在食管鳞癌组织中低表达，miR-21在食管鳞癌组织中高表达。食管癌组织中miR-21和miR-451的表达水平与有无淋巴结转移、食管癌分化程度及TNM分期相关，与病人的年龄、性别和肿瘤部位无相关性。2.上调食管癌EC9706细胞中miR-451表达可有效抑制食管癌EC9706细胞的增殖和侵袭能力，并且促进细胞的凋亡；下调食管癌EC9706细胞中miR-21表达能抑制食管鳞癌细胞系EC9706细胞的生长和侵袭，并促进其凋亡。3.证实TIMP3及FASL为miR-21靶基因，CDKN2D为miR-451靶基因。miR-451通过作用于靶基因CDKN2D的3’UTR参与调控食管鳞癌细胞生长周期；miR-21通过作用于靶基因TIMP3的3’UTR参与调控食管鳞癌细胞侵袭；miR-21通过作用于靶基因FASL的3’UTR参与调控食管鳞癌细胞凋亡。
【作者】王涛；
【导师】郑玉玲；
【作者基本信息】郑州大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】miR-451；miR-21；食管癌；生长；侵袭；凋亡；

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