副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7细菌素的产生与拮抗菌群生态效应的遗传学研究

【摘要】乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌，大多数有保健和医疗功效，还具有改善食品风味、提高食品营养价值及抗菌防腐等作用。副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）HD1.7是从乳酸酸菜发酵液中分离得到的一株乳酸杆菌，在稳定期可产生大量细菌素Paracin1.7。Paracin1.7具有较广的抑菌谱，其产生与密度依赖的群体感应系统（Quorumsensing,QS）有关。研究该细菌素的产生与拮抗菌之间的相互关系，通过调控QS系统，提高细菌素产量，为开发该细菌素作为一种新型的天然食品防腐剂具有重要的理论意义和应用价值。研究结果如下：一、在副干酪乳杆菌HD1.7对拮抗菌生长的影响的研究中发现，较低的菌体密度时，HD1.7仅能延迟大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长周期，而对酿酒酵母没有明显影响。将不同菌体浓度HD1.7培养上清浓缩液（即含有不同浓度细菌素）加入到拮抗菌培养液后，其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌生长有显著的影响。随着浓缩液中细菌素浓度增加，其对拮抗菌的生长抑制作用也在增强，当其浓度达到108CFU/mL后，加入浓缩液的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长受到完全抑制。但是，加入浓缩上清液的酿酒酵母生长无明显差别。HD1.7发酵产生的细菌素Paracin1.7受自身的群体感应调控，当菌体密度较低时，培养液中细菌素Paracin1.7产生量较低，因此对拮抗菌抑制力较低。随着菌体密度的增加，培养液中细菌素Paracin1.7在群体感应的调控下，不断增加，进而对拮抗菌的抑制作用增强。扫描电镜结果显示，细菌素Paracin1.7是通过破坏拮抗菌的细胞壁实现对细菌生长的抑制。二、在拮抗菌群密度和代谢产物对HD1.7细菌素产生的影响研究中发现，枯草芽孢杆菌不同菌体密度发酵上清液和菌体与阈值浓度的菌株HD1.7混合培养时，对Paracin1.7的产生有明显的促进。而不同菌体密度的大肠杆菌和酿酒酵母的菌体和培养上清加入到阈值浓度的HD1.7的培养液中时，它们对细菌素Paracin1.7的产生无促进作用。三、在HD1.7与近源乳酸菌相互影响的研究中发现，不同菌体密度的植物乳杆菌和乳酸乳球菌的菌体和培养上清加入到阈值浓度的HD1.7的培养液时，它们对细菌素Paracin1.7的产生的促进作用不同。植物乳杆菌的培养上清液对细菌素Paracin1.7的产生无促进作用；而不同浓度的菌体对细菌素产生有促进作用。不同菌体密度的乳酸乳球菌的菌体和培养上清液均会促进细菌素的产生。四、本研究还基于iTRAQ技术，构建了HD1.7阈上浓度与阈下浓度差异蛋白表达体系。共鉴定到总蛋白584个，差异表达蛋白110个,其中上调表达63个,下调表达47个。差异蛋白质理论分子量集中在20kDa-30kDa、40kDa-50kDa之间，理论等电点主要分布在pH5-6之间。鉴定到的蛋白共参与21条生物通路，包括糖酵解、柠檬酸循环、氨基酸代谢、氧化磷酸化、嘌呤代谢、嘧啶代谢等生物过程。15.29%的差异蛋白参与糖酵解过程，说明副干酪乳杆菌HD1.7产细菌素过程对菌的基础糖代谢模式进行了调控,也表明糖代谢调控在产细菌素过程中有着重要的作用。9个伴侣蛋白（dnaK、clpB、clpL、clp蛋白酶）表达上调，与QS系统信号分子的前导肽修饰加工有关。氧化磷酸化过程中多个ATP合酶表达上调，产生较多的ATP，与协助AIP实现跨膜运输有关。大量差异蛋白参与多条氨基酸合成代谢通路，与合成细菌素Paracin1.7有关。综上所述，本研究一方面从生态学的角度探讨副干酪乳杆菌HD1.7产生细菌素与拮抗菌群的相互关系，及HD1.7产生细菌素与近源乳酸菌的相互关系。另一方面从蛋白质组学的角度，应用iTRAQ技术，构建了HD1.7阈上浓度与阈下浓度（即产生细菌素与不产生细菌素）差异蛋白表达体系，经分析HD1.7启动QS产生Paracin1.7过程中蛋白质表达差异变化，说明了QS产生细菌素Paracin1.7这一生理过程的机制，为革兰氏阳性菌QS机制提供了蛋白组学的证据。为下一步副干酪乳杆菌HD1.7产生细菌素的研究提供了有参考价值的资料。
【作者】付海燕；
【导师】徐香玲；平文祥；
【作者基本信息】哈尔滨师范大学，遗传学，2014，博士
【关键词】副干酪乳杆菌；群体感应；细菌素Paracin1.7；iTRAQ；

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