AnFALDH与CcFALDH基因的克隆及其在甲醛代谢中的功能研究

【摘要】甲醛是重要的化工原料，广泛应用于人类生活密切相关的各种工业产品中。2004年甲醛被正式列入人类致癌物名单。目前，对一些甲醛净化生物甲醛代谢机制的研究较少，很多生物都具有优良吸收甲醛和降解甲醛能力，但是，其基因资源都没有得到有效的发掘和利用。本研究选择两种具有高效吸收甲醛能力的生物，对甲醛代谢中的关键酶——依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶进行克隆与功能研究，主要研究结果如下：1.耐甲醛真菌AspergillusnomiusSGFA1在甲醛处理下的基因表达分析利用Real-timePCR分析不同甲醛代谢途径的基因在甲醛处理下的表达特性。结果表明：ALDH（醛脱氢酶），FALDH（甲醛脱氢酶），FGH（S-甲酰谷胱甘肽水解酶），FDH（甲酸脱氢酶）和yap1-like（酵母AP1类似基因）等5个基因对甲醛的诱导有响应。但酶活性分析显示，ALDH和yap1-like是甲醛诱导的胁迫应答基因，不直接参与甲醛代谢；FALDH，FGH和FDH是参与AspergillusnomiusSGFA1的主要甲醛氧化代谢途径的关键基因。2.AnFALDH基因的克隆与序列分析克隆获得的AnFALDH基因，预测结果显示：AnFALDH基因含有1146个核苷酸，编码381个氨基酸，BlastX比对结果显示AnFALDH基因属于MDR（mediumchaindehydrogenase/reductase）家族，包含有ADH_N结构域和锌结合蛋白结构域，估计分子量为40.4kDa，理论等电点（pI）为7.07。3.AnFALDH基因提高酵母对甲醛的抗性获得含有AnFALDH基因的酵母转化子，通过对转化酵母和野生型进行生理功能比对，结果显示AnFALDH基因能提高酵母对甲醛的抗性，与野生型相比转化酵母吸收甲醛能力提高约22.3%。4.CcFALDH基因的克隆与序列分析从吊兰（Chlorophytumcomosum(Thunb.)Baker）中克隆获得的FALDH基因含有1140个核苷酸，编码379个氨基酸。BlastX比对结果显示CcFALDH基因属于MDR家族，包含ADH_N结构域和锌结合蛋白结构域。估计分子量为40.6kDa，理论等电点（pI）为6.51。多重序列比对分析表明植物FALDH基因高度保守。5.CcFALDH基因的超量表达及分子生物学检测构建含有35SCaMV启动子的CcFALDH组成型植物表达盒，转化农杆菌菌株EHA105，用农杆菌介导的方法对烟草进行遗传转化。对36株卡那霉素筛选获得阳性烟草植株进行PCR鉴定，共获得14株PCR阳性植株。对PCR阳性的转基因烟草进行Southernblot检测，有7株鉴定为阳性植株。选择Southernblot检测为单拷贝植株进行Northernblot分析。结果显示有5株有杂交信号（分别为TR1、TR3、TR7、TR9、TR15），证明CcFALDH基因在RNA水平上稳定表达。6.转CcFALDH基因烟草的功能分析在含150mgl-1甲醛的培养基上，野生型烟草的萌发率只有转基因烟草的一半；在不含甲醛的对照培养基中，转基因植株与野生型的萌发率没有差异。在含甲醛培养基上的野生型烟草生长受抑制，而转基因烟草能正常生长。在含150mgl-1甲醛的芽诱导培养基中野生型烟草叶片7d后已经全部白化死亡，而转基因烟草能够形成愈伤组织并分化。甲醛处理后烟草的总叶绿素含量都减少，但野生型烟草的总叶绿素含量仅达到转基因烟草的一半。WT、TR7、TR15中FALDH酶的活性分别为0.033、0.104和0.108Umg-1蛋白，转基因烟草品系FALDH活性比野生型高约3.3倍。转基因烟草TR7和TR15吸收水溶液中甲醛的能力分别比WT提高2.18和1.89倍。对于气体甲醛，TR7和TR15单位叶面积吸收甲醛量高于野生型烟草分别约2.18和1.8倍。
【作者】于典司；
【导师】郭长虹；
【作者基本信息】哈尔滨师范大学，遗传学，2014，博士
【关键词】甲醛；AspergillusnomiusSGFA1；吊兰；甲醛脱氢酶；甲醛代谢；

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