杧果畸形病病原遗传多样性及其与杧果互作机制研究

【摘要】由镰刀菌引起的杧果畸形病是杧果生产上的重要病害之一,迄今为止未发现抗病品种及根治杧果畸形病的有效方法。因而进行病原菌种群分析及其与寄主互作机制的研究,挖掘寄主耐抗病的有效基因,无疑会为抗病育种工作奠定理论基础。本研究通过营养亲和群和ISSR技术分析了我国杧果畸形病病原菌的遗传多样性,通过生理生化测定、转录组学信息分析探索了杧果与Fusariummangiferae的互作机制,主要取得以下结果。1、从我国杧果畸形病发病地采集病组织进行分离,柯赫氏法则验证后共获得38个致病菌,经形态学和EF-α延伸因子序列分析鉴定为Fmangiferae。运用VCG和ISSR标记技术对获得的38个畸形病病原菌进行遗传多样性分析。VCG研究结果表明,通过在含KClO3培养基(KPS)上诱导筛选,共获得抗氯酸盐、不能利用硝酸盐营养突变体(nit)455株,通过MM、NM和HM3种不同氮源培养基划分出nitA、nitB、nitC、nitD四种突变类型,其中nitA出现频率最高,占总体的78.02%；nitB和nitC其次,分别占7.91%和13.63%；nitD最少,仅占0.44%。采用nit突变体互补型配对技术,将获得的突变菌株进行配对培养,测得不同的营养体亲合群(VCGs)数为5个,其中VCG1内包含30个菌株,3个菌株分布在yCG2内，VCG3和VCG4内各含有2个菌株,菌株MG33单独形成VCG5。ISSR分子标记结果显示,供试的38个菌株经14条特异性引物共扩增出72条带,产物条带介于300-2000bp,其中52条带具有多态性,多态性比率为72.22%。38个菌株的相似系数值为0.5972-0.9862,其中菌株MG16和MG17之间的相似系数最大,为0.9862,菌株MG07和MG33的遗传相似系数最小,为0.5972。利用UPGMA法进行聚类分析,在相似系数为0.76水平上分为5类,33个菌株分布在第V类中,MG25和MG35聚合在一起(Ⅳ),菌株MG36(Ⅲ).MG07(Ⅱ)和MG33(Ⅰ)分别形成单一分支。2、杧果畸形病病原菌生物学特性测定结果表明：供试的38个菌株对杧果的致病力存在一定的差异。病原菌在燕麦培养基上生长速度最快,在液体马铃薯葡萄糖培养基中生长量最大,最佳产孢培养基为马铃薯蔗糖培养基；菌丝生长、孢子产生和萌发的最佳温度均为25℃-28℃；光照和pH4-10的酸碱度对F.mangiferae菌丝生长速度、孢子产生及萌发的影响不明显。F.mangiferae生长的最好碳氮源分别为蔗糖和酵母提取物。菌丝和分子孢子的致死温度分别是53℃和57℃。毒力测定结果表明：25%咪鲜胺乳油对病原菌菌丝生长的抑制效果最好,EC50和EC95分别为1.2004μg·mL-1和2.6239μg·mL-1;25%嘧菌酯悬浮剂能够强烈抑制病原菌分生孢子的萌发,EC5o和EC95分别为0.5312μg·mL-1和2.9741μg·mL-1。3、杧果与F.mangiferae互作生理机制研究结果表明,①接种病菌后,杧果顶芽内光合色素含量、可溶性总糖、还原性糖、蔗糖和葡萄糖含量均先上升后下降；淀粉和纤维素含量随着接种时间的延长而不断下降。在接种病菌初期,中性转化酶和蔗糖合成酶(合成方向)的活性上升。接种病菌后期,中性转化酶、蔗糖合成酶(合成方向)和蔗糖磷酸合成酶活性下降,而蔗糖合成酶(分解方向)活性不断上升。②病菌的侵染能够引起杧果体内矿质元素含量发生改变,其中N、K、Fe和Mn的含量随着接种时间的延长不断上升,且上升幅度较大,其次是P、Mg、B和Zn,Cu和S的含量变化不明显,Ca随着接种时间的延长其含量不断降低。③可溶性蛋白和RNA含量均呈现先上升后下降的趋势,接种病菌45d时达到最大。DNA含量呈现不断上升的趋势。④F.mangiferae侵染促进杧果顶芽O2产生速率、H2O2和MDA含量的增加；在F.mangiferae侵染杧果后,谷胱甘肽含量急剧下降,POD、CAT、SOD和GR的活性迅速上升,且在整个测试过程中始终维持在较高水平,而APX活性呈现先上升后下降的变化趋势。⑤接种病菌后,杧果顶芽内赤霉素和生长素含量急速上升,且在整个试验阶段明显高于对照处理,脱落酸含量在试验后期不断升高。⑥病菌侵染对杧果顶芽的酚类代谢也产生了一定的影响,接种病菌45d内,杧果顶芽总酚、类黄酮含量及PAL酶活性均明显提高,随后急速下降,PPO活性初期变化不大,后期不断上升。4、基于IlluminaHiSeqTM2000平台,对健康与感病杧果顶芽的转录组进行了测序,采用BLAST软件将获得的Unigene与nr、Swiss-Prot、KEGG和COG数据库进行比对,基因功能注释后分析杧果病健组织的差异表达基因(DEGs),并对DEGs进行GO和Pathway富集分析。结果表明,①2个样品共获得119,815条Unigene,N50为1546,平均片段长度880bp。经RPKM法分析后共获得29,878个DEGs。以corrected-pvalue≤0.05为阈值的代谢途径有22条,其中大多数代谢途径与植物的抗逆响应密切相关。②153个DEGs参与了淀粉和蔗糖代谢途径,DEGs主要是编码糖类异构酶、水解酶和转移酶等,参与葡糖糖水解、细胞碳水化合物、丙酮酸盐和核苷酸代谢等生物进程。③在抗氧化生物过程中,编码活性氧代谢相关酶且差异倍数在5倍以上的DEGs有24个,19个属上调表达。表明活性氧代谢在杧果与病原互作过程中起到重要的调解作用。④F.mangiferae侵染杧果后,以差异倍数在10倍以上为筛选条件,共获得酚类代谢相关差异表达基因53个,其中40个DEGs上调表达,推测杧果可能是通过合成加固细胞壁的木质素或生成抑菌作用的酚类化合物来提高对病原菌的抵抗能力。⑤杧果与F.mangiferae互作过程中,钙信号传导、SA信号途径和丝裂原活化蛋白信号传导途径相关基因表达下调,造成了下游植物抗病基因RPM1的表达受到抑制,这可能是杧果感病的主要原因之一。
【作者】柳凤；
【导师】韦继光；
【作者基本信息】广西大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】杧果畸形病；遗传多样性；生物学特性；生理机制；转录组；

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