白菜花粉发育相关microRNA的筛选鉴定与功能研究

【摘要】microRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA分子,它们对基因的表达起到负调控作用。大量的文献报道miRNA参与植物的生长发育和胁迫反应过程。花粉发育是种子植物生命周期中一个非常重要的过程,它关系到种子的多少和种子质量的好坏,尤其是对蔬菜等农作物产量的高低和品质的优劣等起着决定性的作用。然而,miRNA在种子植物的有性生殖过程,尤其是参与花粉发育过程方面的研究成果还较少,不足以认识它们在花粉发育过程中所起的调控作用。本文以白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisMakino,syn.B.rapassp.chinensis)‘矮脚黄’核雄性不育(’Aijiaohuang’genicmalesterility,ajhGMS)两用系Bcajh97-01A/B’为材料,通过植物miRNA芯片技术筛选不育株系’Bcajh97-01A’和可育株系’Bcajh97-01B’花序中差异表达miRNA;随后,分别以’Bcajh97-01A’和’Bcajh97-01B’的花蕾混合样为样品建立小RNA文库,利用高通量测序技术进行测序,鉴定白菜保守的miRNA和新的miRNA,同时筛选两个样品中差异表达的miRNA;运用降解组测序技术对miRNA的靶基因进行分析和鉴定；最后,对白菜花粉发育相关基因MIR158的功能进行深入研究。主要研究结果与结论如下：(1)利用植物miRNA芯片技术筛选白菜雄性不育两用系的不育株系’Bcajh97-01A’和可育株系’Bcajh97-01B’的花序中差异表达miRNA。芯片结果表明’Bcajh97-01A’和‘Bcajh97-01B’的花序间存在44个差异表达的miRNA,其中有15个miRNA的差异表达倍数大于1.5倍,这15个miRNA中有9个miRNA在’Bcajh97-01A’花序中上调表达,剩下的6个miRNA在’Bcajh97-01A’花序中下调表达。通过生物信息学预测,发现其中miR158、miR168和miR172家族在白菜中一共存在13个成员,以及22个潜在的靶基因。利用5’modifiedRACE验证得到miR158的靶基因1个、miR168的靶基因2个和miR172的靶基因5个。利用qRT-PCR方法对这3个miRNA在五个花粉发育阶段对应的第1至V级花蕾中的表达情况进行分析,验证了miRNA芯片的结果。(2)以白菜’Bcajh97-01A’和’Bcajh97-01B’的不同大小花蕾的混合样为样本,分别建立小RNA文库,经IlluminaSolexa系统进行深度测序。通过深度测序一共获得了8条位于已知pre-miRNA上的miRNA*序列、54条植物保守的miRNA序列和8条家族新成员序列,并且获得了25对新的miRNA/miRNA*.在这些鉴定到的miRNA中有18个miRNA在’Bcajh97-01A’和‘Bcajh97-01B’的花蕾混合样中差异表达。qRT-PCR分析结果表明绝大多数差异表达miRNA在’Bcajh97-01B’花蕾混合样中的表达量较高。(3)以’Bcajh97-01B’的花序为样品建立降解组文库,经IlluminaSolexa系统进行降解组测序,结合前期利用miRNA高通量测序中鉴定得到的miRNA序列进行降解组数据分析,最后一共分析得到9个miRNA家族的18个靶基因,并通过5’modifiedRACE验证得到2个miRNA家族的3个靶基因。(4)通过对MIR158基因的表达和功能分析,发现MIR158参与调控花粉发育过程,其靶基因Bra027656编码一个非典型的属于P亚家族的PPR蛋白,可能在花粉发育早期起作用。miR158是前期分别利用miRNA芯片和高通量测序在Bcajh97-01A和Bcajh97-01B的花序和花蕾中筛选到的差异表达miRNA.通过构建35S::MIR158过表达载体,利用改良的菜心遗传转化体系,获得了MIR158过表达转基因菜心植株mir158oe以及pB1121空载对照转基因植株。qRT-PCR分析结果表明,miR158在mir158oe的植株中上调表达,Bra027656在,nir158oe的植株中下调表达。观察mir158oe以及空载对照植株表型,发现它们的营养生长均正常,能正常开花产生花粉,没有发现两种类型的植株间存在差异。通过花粉染色观察发现mir158oe植株中大量花粉没有活力。观察花粉体外萌发,结果显示对照植株96.8%的花粉体外正常萌发,而mir158boe仅有11.4%花粉正常萌发。同时,观察花粉体内萌发,结果表明MIR158在菜心植株中过量表达导致花粉体内萌发率降低。利用扫描电镜观察,发现对照植株花粉形态99.2%发育正常,而mir158oe中90%花粉发育畸形。这些结果表明MIR158在菜心植株中的过量表达导致花粉发育异常。通过对miR158的靶基因Bra027656的核苷酸和氨基酸序列进行分析,发现该基因编码一个非典型的属于P亚家族的PPR蛋白,qRT-PCR分析结果表明它在花粉发育早期在Bcajh97-01A和‘Bcajh97-01B的花蕾中差异表达,结合MIR158的功能分析,推测它可能是一个在花粉发育早期起作用的基因。
【作者】江建霞；
【导师】曹家树；
【作者基本信息】浙江大学，蔬菜学，2014，博士
【关键词】白菜；Brassicacampestrisssp.chinensis；Brassicarapassp.chinensis；花粉发育；雄性不育；microRNA(miRNA)；miRNA芯片；高通量测序；降解组测序；MIR158；

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