耐辐射奇球菌MutS2和DncA蛋白结构与生化功能的研究

【摘要】耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)对电离辐射、紫外照射、干旱、过氧化氢等DNA损伤胁迫具有惊人的抵抗性,因其著名的DNA损伤修复能力而被作为研究DNA损伤修复的模式生物。本研究主要对D.radiodurans中两个核酸酶MutS2及DncA(DR2417)的结构与功能进行了研究。MutS2的同源物广泛存在于原核生物中,主要参与DNA修复及活性氧清除等,其C末端Smr结构域是其核酸酶活性的核心结构域,而该蛋白详细的催化机制至今也不清楚。本文中,我们首先研究了D.radiodurans中drMutS2的体内功能,构建了△mutS2突变株和△recA△mutS2双突变株,表型分析结果表明与△recA突变株相比,双突变对电离辐射和过氧化氢处理更为敏感,这说明drMutS2可能参与了一条不依赖RecA的途径来增强细胞的DNA氧化损伤抗性。同时,mutS2基因的敲除诱导了细胞氧化还原能力和维生素B1的合成。为了鉴定drMutS2催化位点,我们结晶了Smr结构域并用Mn2+soaking的方法获得了两组高分辨率的衍射数据。出人意料的是,与普通的Smr晶体相比,Mn2+浸泡过的晶体空间结构群从单斜晶系变成了正交晶系,且分辨率也由原来的1.4A提高到了1.2A,这也是目前所知研究Smr结构获得的最高分辨率。结构比较可知,α1螺旋上的三个氨基酸残基在金属离子浸泡后发生了构象改变。定点突变获得点突变蛋白后测定核酸酶活性发现E710突变成丙氨酸后drSmr活性明显降低,体内补偿该点突变并没能改变AmutS2突变株的表型,因此我们认为氨基酸残基E710应该包含在活性中心。有报道称D.radiodurans中β-CASP家族的核酸酶DncA(DR2417)在变性又复性的状态下具有Mn2+依赖的3’-5’dsDNA核酸外切酶活性及ssDNA/dsDNAjunction的核酸内切酶活性,但对RNA几乎没有活性。本文成功表达纯化了自然折叠状态下的DncA蛋白,核酸酶活性测试发现DncA具有Mn2+依赖的5’-3’ssDNA核酸外切酶活性及overhangprocessing的核酸内切酶活性,在低pH下具有Artemis类似的打开发夹DNA的功能,同时DncA具有很强的RNase活性。结构生物学研究显示DncA与RNaseJ相似,由β-lactamase、β-CASP及C-末端三个结构域组成。定点突变的方法得到了DncA功能完全丧失的点突变蛋白D175A,该蛋白与ssDNA复合物的结构显示DncA拥有一个更大的底物容纳空间,这也预示了DncA蛋白能够与更复杂的DNA底物结合。DncA蛋白的C末端在二聚化作用中起了关键作用,且C末端截短的蛋白在酶切复杂结构DNA时受到抑制。遗传学研究发现,dr2417基因甚至C端截短蛋白的基因(dr2417△C)均不能被完全敲除,电离辐射等表型实验结果表明杂合的dr2417突变株几乎没有明显表型,而dr2417△C的杂合突变株则表现出明显的表型。这些结果说明DncA以及该蛋白C末端在D、radiodurans中的重要性。
【作者】张慧；
【导师】华跃进；
【作者基本信息】浙江大学，生物物理学，2014，博士
【关键词】耐辐射奇球菌；氧化损伤；晶体结构；核酸酶；活性位点；MutS2；Smr；DncA；

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