寄主miRNAs调控小麦与条锈菌互作的分子机理

【摘要】由条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麦条锈病是世界范围内的一类重要气传真菌病害。国内外研究表明,选育并合理利用抗锈品种是控制小麦条锈病最经济、安全、有效的措施。但是由于条锈菌毒性不断变异,导致小麦品种抗性很快丧失。因此,研究小麦与病原菌互作分子机理对于开发新的持久防治病害策略具有重要意义。小麦对条锈病的抗性分为全生育期抗性(苗期抗性)和成株期抗性。与全生育期抗性相比,成株抗性表现出更稳定,更持久的特征。成株期抗性是指在遗传背景没有变化的情况下,植株由苗期感病转变为成株期抗病。前期转录组分析表明,苗期的亲和互作以及成株期的非亲和互作中,差异表达基因的种类及数量没有明显差别,只是表达强度和持续时间的差异导致了抗病性的变化,因而转录后水平的调控可能在成株期抗性中发挥重要作用。miRNAs是近年来发现的一类在转录后水平通过调控靶标基因参与植物生长发育以及抗逆胁迫等多个生理生化过程的小分子调控因子。为了明确miRNAs是否参与调控小麦成株抗条锈性,本论文首先通过深度测序,明确了具有成株期抗性小麦品种兴资9104两个生长时期(苗期和成株期)niRNAs的表达特征,获得了不同发育阶段特异表达的miRNAs,并进一步验证了部分miRNAs在不同叶片的表达水平；同时明确了部分miRNAs在小麦与条锈菌互作中的表达趋势。通过降解组测序鉴定获得了兴资9104相关miRNAs的靶标基因,进而通过病毒诱导的基因沉默、瞬时表达等技术方法明确了活性氧代谢以及蛋白质降解通路的靶标基因功能。并借助水源11与条锈菌的互作体系分析了两个保守miRNAs及其靶标基因在小麦对条锈菌基础抗性中的作用。上述研究揭示了小麦与条锈菌成株期、苗期互作的miRNAs表达特征；鉴定了参与苗期感病和成株期抗病的重要miRNAs,明确了其作用机理,为深入的阐明小麦与条锈菌互作过程中niRNAs的调控机理奠定基础,加深了对小麦与条锈菌互作分子机理的认识,进而为该病害的持久控制新策略的制定提供了理论依据。主要研究结果如下：明确了小麦与条锈菌互作的miRNAs表达特征及其互作靶标利用深度测序技术,分别对兴资9104苗期接菌(ST-I),苗期对照(ST-M),成株期接菌(AT-I)以及成株期对照(AT-M)进行miRNAs的鉴定。在苗期两个数据库中,共鉴定了533个miRNAs,包括36个小麦已知的miRNAs,其余497个新发现的：niRNAs包括7个保守的miRNAs以及490个非保守的小麦miRNAs。而在成株期两个数据库中,共获得了636个miRNAs,其中526个为小麦特异的miRNAs,其余110个miRNAs包括了42个保守miRNAs以及68个能够与其他物种匹配上的miRNAs。数据比较分析发现,大部分miRNAs序列在不同生长时期是一致的,只是表达水平存在一定差异。利用northernblot技术分析了12个特异miRNAs在不同生长发育时期的表达情况,发现它们具有组织表达特异性,并且在小麦倒二叶和旗叶具有相似的表达水平。另外,利用microarray技术,分别筛选得到了不同生长时期兴资9104与条锈菌互作的miRNAs;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,分析了15个miRNAs在兴资9104接种条锈菌后不同时间点后的表达变化。发现它们均能受条锈菌侵染的诱导,并呈现出多种表达趋势。这表明兴资9104苗期的感病互作以及成株期的抗病互作并不是由某一个或者一类miRNAs调控决定的,而是多个miRNAs不同的差异表达调控了小麦对条锈菌的抗性。同时,利用降解组测序的方法对miRNAs的靶标基因进行了鉴定。发现大多数能够注释的靶标序列与信号转导,能量代谢等关键的生物学过程相关。根据表达丰度,选择15条序列进行表达水平分析,发现它们也呈现了多种表达趋势。另外,通过分析发现大多数miRNAs与靶标序列处于一个调控网络中,一对一的调控模式并不多,说明miRNAs参与的调控网络非常复杂。利用条锈菌基因组信息,还预测得到了3个小麦苗期miRNAs的靶标基因,为进一步研究寄主与病原互作机理提供一个新的方向。另外,测得的大多数靶标基因序列是未能注释的,随着基因功能的不断开发,miRNA的功能也会随着被揭示。小麦成株期抗性miRNA及其靶标基因的鉴定和功能解析通过降解组测序,发现1136-P3和PN-2013靶标同一条序列,利用烟草共转化实验验证了该序列均能被这两个miRNAs有效裂解。qRT-PCR分析发现仅PN-2013受条锈菌侵染调控表达,参与了兴资9104与条锈菌的互作。利用电子克隆技术,克隆得到了小麦1136-P3和PN-2013的靶标基因TaMDHAR,发现两个miRNAs的靶标裂解位点均在TaMDHAR的3’UTR区。经过生物信息学分析,该基因与山羊草单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)基因近缘。与拟南芥六个MDHAR基因比对发现与MDHAR2同源性更高。同时,TaMDHAR和PN-2013在小麦苗期与条锈互作中的表达趋势称相异的趋势；沉默TaMDHAR之后,小麦苗期呈现抗性增强的现象。分析发现,这可能是由于TaMDHAR的沉默导致了AsA含量的降低,进而促使APX和CAT活性降低,从而增加了过氧化氢的积累,促进了HR反应的发生。同时,根据降解组测序获得了PC-395的靶标序列,利用烟草共转化实验验证了该序列能够被PC-395有效地裂解。qRT-PCR分析发现PC-395能够受到条锈菌侵染的显著诱导,因此,利用电子克隆技术克隆了小麦PC-395的靶标基因,并命名为TaULP5。发现PC-395和TaULP5在小麦苗期与条锈菌的互作中具有相异的表达趋势。经过生物信息学分析,该基因与短柄草和大麦的泛素类蛋白5(ULP5)基因近缘。TaULP5定位在拟南芥原生质体细胞质中。利用酵母突变体验证了该基因具有类泛素蛋白5的功能。TaULP5在酵母中过表达之后,提高了酵母菌的抗高盐以及H202的能力。另外,沉默TaULP5之后,一些抗病相关蛋白的表达水平提高,小麦苗期抗锈性增强。由此可见,该基因在生物胁迫和非生物胁迫中可能发挥着不同的功能。调控小麦基础抗性miRNA及其靶标基因的功能解析前期研究认为,保守的miRNAs可能在植物与病原菌的PTI互作中起重要作用。qRT-PCR分析发现,tae-miR164、tae-miR408在兴资9104不同生育期与CYR32互作中的表达模式与水源11与无毒小种CYR23和毒性小种CYR31的互作中的表达趋势基本一致,表明二者可能在小麦的基础抗性中发挥着一定的作用。为此,本文利用水源11与条锈菌的互作体系分析了tae-miR164、tae-miR408及其靶标基因的功能,为进一步揭示保守miRNAs在植物与病原物互作中的作用奠定基础。首先,通过电子延伸,从具有全生育期抗性品种水源11中扩增得到了小麦tae-miR164的靶标基因TaNAC21/22.利用烟草共转化技术,验证了TaNAC21/22够被tae-miR164有效裂解。TaNAC21/22具有典型的NAM结构域,属于NAM亚家族。经过生物信息学分析,该基因与大麦NAC基因和短柄草NAC21/22基因同源性最高。同时,tae-miR164和其对应的靶标基因TaNAC21/22在小麦与条锈互作中的表达趋势称相异的趋势,符合miRNA与靶标基因的互作关系。作为转录因子,蛋白被定位于细胞核中,与此同时,TaNAC21/22具有基因的转录激活功能。更重要的是,TaNAC21/22被沉默之后,小麦呈现抗性增强的现象。这说明,作为一类转录因子,TaNAC21/22负调控小麦对条锈菌的抗病反应。另外,利用电子克隆技术,从水源11中克隆得到了小麦tae-miR408的靶标基因TaCLPl。该基因ORF内具有tae-miR408的裂解位点,能够被tae-miR408有效地裂解。经过生物信息学分析,该基因与大麦BCP基因同源性最高。tae-miR408和其对应的靶标基因TaCLPl在小麦与条锈互作中的表达趋势称相异的趋势；作为铜离子绑定蛋白,受到铜离子诱导后,tae-miR408和TaCLP1也出现了相异的表达趋势。与此同时,在酵母中过表达TaCLP1提高了酵母抗高盐和高铜离子浓度的能力。更重要的是,通过病毒诱导的基因沉默证实了TaCLP1正向调控小麦对条锈菌的抗病反应。
【作者】冯浩；
【导师】康振生；
【作者基本信息】西北农林科技大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】小麦条锈病；miRNAs；靶标基因；成株抗病性；功能验证；

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