百合不同器官转录组分析及SSR标记开发应用

【摘要】百合是百合属所有种、亚种、变种、变型和品种的统称,是以观花为主的具有重要商业价值的球根花卉。百合的细胞遗传学和育种研究已取得重大研究进展,但是分子遗传学研究却相对滞后。百合复杂而巨大的基因组(36Gb)可能是其分子遗传学研究难以深入开展的限制因子。要提高百合选择育种效率,需要研究建立性状控制的分子遗传学基础,有必要建立百合的基因组信息库。为此,本论文采用IlluminaHiSeq2000测序平台和生物信息学分析手段,构建了百合根、鳞茎、茎皮、叶片、花瓣和柱头六种器官等量混合样的转录组数据库,在此基础上,分析百合鳞茎、叶片和花朵的表达谱数据库,开发了SSR标记,利用SSR标记开展了种质资源遗传多样性评价和育种材料研究。具体研究结果如下：1、获得4.6Gb百合多个器官转录组数据,包括49,991条转录本,总长33,624,313nt,平均长度为673bp,约占全基因组的0.1%。其中,72%的转录本可以比对到各蛋白数据库中。全部转录本中,预测到39,658个编码区,发现百合微卫星中三核苷酸重复基元的数量大于二核苷酸重复基元的数量,二、三核苷酸重复基元的主要类型分别为GA/CT和GGC/CCG。利用已公布的两个百合转录组信息,整合得到了6个品种/品系、7个器官的杂交组装转录组数据L.-Unigene-All,含有69,615条转录本,平均长度1600bp。不同转录组数据转录本的GO分类结果十分相似。百合转录组数据库的获得是百合基因研究的基础,将有助与百合表达谱研究和功能基因的挖掘。2、获得了百合花、叶、鳞茎三个器官各11Mb的表达谱数据库。经显著性筛选,在叶片和花朵中得到差异基因2685个,叶片和鳞茎差异基因2296个,花朵和鳞茎差异基因1709个。三个器官共有的差异基因74个,主要参与光合作用、次生物质代谢、信号转导、氮代谢、植物-病原互作、糖/脂类／蛋白／核酸代谢等。表达谱中的新转录本占转录本总数的17%。三个器官的差异基因分别参与了一百多个代谢途径。途径富集分析表明,花器官特异基因主要参与了黄酮、类黄酮等次生代谢物的生物合成,叶器官特异基因主要参与了光合作用,鳞茎特异基因主要参与了淀粉和糖代谢活动。特别关注了参与花色形成的DFR、参与花香形成的LcTPS、参与光合作用的psbA和参与淀粉代谢的SBE基因。百合器官发育表达谱的构建为候选基因的挖掘及功能研究奠定了分子基础。3、通过调整DNA浓度、聚合酶产品和用量、PCR反应增强剂的种类和退火温度,利用添加通用荧光标识引物M13的两步PCR法建立并优化了百合毛细管电泳筛选标记的反应体系。利用NCBI的EST库和本实验获得的转录组数据库筛选SSR位点并设计引物,筛选出61个具有多态性的位点。61个引物对在32个百合基因型中共扩增到153个等位基因,平均等位基因数5.7个,平均多态性信息含量0.55。通过对杂交组装前后转录本的联配,认为SSR标记开发数量少的原因,是引物不特异和百合基因组大而复杂造成的。已开发的新标记将有益于百合种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建和亲本鉴定。4、使用荧光毛细管电泳法,从其他研究者已报道的51个标记中筛选出34个通用性好的标记,加上本研究新开发的61个,共采用95个标记分析69份百合材料的遗传多样性,共扩增出611个多态性等位基因,平均等位基因数6.43、多态性信息含量0.55、平均观察杂合度0.50、平均期望杂合度0.60。其中,有75个稀有等位基因,主要存在于野生型百合中。95个标记将69份百合材料分为东方百合和非东方百合两大类,野百合和巨球百合聚在了一起,北京山丹和山西山丹聚在了一起。使用零错配和不含无效等位基因的标记鉴定出11-45、11-93、11-94、11-150和11-173可能的父本分别为’CocarD’or’、’ColdPlay’、’Ariosto’、’Souvenir’和’LoveStory’。总之,这95个标记可用于百合属系统发育研究和亲本鉴定。此外,首次报道了29个百合SSR标记可以应用于萱草属。
【作者】杜方；
【导师】高中山；夏宜平；
【作者基本信息】浙江大学，观赏园艺学，2014，博士
【关键词】百合；转录组；表达谱；SSR；亲本分析；

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