深海嗜热噬菌体GVE2裂解宿主菌的机制及GVE2感染相关代谢物的功能研究

【摘要】众所周知,海洋覆盖了地球70%多的地表,蕴育着丰富和独特的生物资源,相比于陆生生物资源,人们对于海洋生物资源的认识和开发还处于起步阶段。自从1977年美国阿尔文号深潜器在太平洋首次发现了深海热液口后,深海热液口的生态系统和生物资源便受到了人们极大的关注。在深海热液口生态系统中,一些化能合成细菌和古菌能够利用地热能和化能来合成有机物,它们是整个生态系统中食物链的基础。近年来的研究发现在这些细菌和古细菌中存在着大量的病毒,这些病毒能够通过裂解细菌和古菌来破坏食物链的基础,从而极大地影响热液口生态系统的群落结构。同时,这些嗜热病毒还能够通过裂解宿主菌释放出可溶性的有机物来参与地球化学物质循环。因此对嗜热病毒尤其是嗜热菌噬菌体裂解宿主菌分子机理的研究,不仅能让我们了解在高温条件下病毒是如何裂解宿主菌的,而且在我们理解嗜热病毒对深海热液口生物群落和地球化学物质循环的作用方面具有非常重要的意义。本试验研究了深海热液口高温噬菌体GVE2裂解其宿主嗜热细菌Geobacillussp.E263的分子机理。我们的研究发现,作为双链DNA噬菌体,GVE2能通过编码两种蛋白endolysin和holin来参与宿主菌的裂解过程。endolysin蛋白是一种胞质蛋白具有多种肽聚糖水解酶活性,它能够特异性地识别和降解宿主菌的细胞壁。然而endolysin蛋白自身不能跨膜运输到细胞壁上,它需要另外一个蛋白holin的辅助。holin蛋白是噬菌体编码的一种膜蛋白,在特定的时间和条件下,它能够在细胞膜上聚合并形成孔洞复合物,帮助endolysin蛋白从胞质中释放到细胞壁上。为了研究holin和endolysin蛋白在裂解中的作用,首先我们研究了GVE2感染的宿主菌Geobacillussp.E263的生长曲线,结果表明GVE2的感染能够导致宿主菌的裂解。接着,通过荧光显微镜观察到在GVE2感染后endolysin-GFP能够在宿主菌中聚集,表明endolysin蛋白在宿主菌裂解中发挥重要作用。随后,我们通过-Northernblot和Westernblot研究GVE2感染后宿主菌内endolysin和holin的表达量,结果表明从GVE2感染开始到宿主菌的裂解,endolysin和holin蛋白在宿主菌内都表达。细菌双杂交试验表明,宿主ABC转运蛋白(ABCtransporter)能与噬菌体编码的endolysin蛋白相互作用。ABCtransporter蛋白是—种依赖于ATP的跨膜转运蛋白,ABCtransporter与与endolysin蛋白的相互作用可能有助于endolysin从细胞质中的释放,进而促进宿主菌的裂解。在了解GVE2裂解宿主嗜热细菌Geobacillussp.E263的分子机理后,我们研究了细菌骨架蛋白MreB在GVE2侵染中的作用。MreB是一种在大多数杆状细菌中都存在的骨架蛋白,它与真核生物细胞的肌动蛋白actin具有同源性,MreB在维持细菌形态以及引导细菌细胞壁肽聚糖合成过程中发挥着非常重要的作用。本试验通过相差显微镜观察发现,MreB的特异性抑制剂A22和MP265能够通过抑制细菌MreB的聚合来改变细菌的形态。荧光显微镜观察结果表明,MreB-GFP能够与GVE2病毒颗粒共定位,结果揭示宿主MreB的聚合影响GVE2的侵染。我们进一步探寻从深海热液口微生物中获得有益生物资源的可能性。在噬菌体感染宿主菌后,宿主菌抵御噬菌体侵染可体现在蛋白、代谢物等分子水平。尤其是宿主菌在代谢水平上的扰动可能会产生一些具有抗噬菌体活性的小分子化合物,这些活性化合物可能具有潜在的抗病毒和肿瘤的活性。为此在本试验中,我们通过GC-MS和LC-MS方法分析了GVE2感染和未感染条件下宿主菌Geobacillussp.E263的次生代谢产物变化。通过分析发现,有27种代谢物含量发生了显著变化,对其中3种GVE2感染后上调的代谢物色醇、对羟基苯甲醇、腺嘌呤进行了进一步研究。荧光定量PCR试验表明,色醇能够显著地抑制GVE2的感染和复制,而腺嘌呤能够促进GVE2的感染和复制。进一步试验发现,色醇能够与宿主的Clp蛋白酶发生相互作用。Clp蛋白酶是细菌中的一种蛋白水解酶,它能够通过-水解细菌中的蛋白底物来帮助细菌在逆境中生存。同时,还有研究报道发现Clp蛋白酶在噬菌体感染大肠杆菌的过程中发挥着重要的作用。因此,在本研究中色醇可能是通过与Clp蛋白酶的相互作用来参与宿主菌对噬菌体侵染和裂解的抵御。另—方面,我们研究了GVE2感染相关代谢产物在抗肿瘤中的作用。研究结果表明,GVE2感染的Geobacillussp.E263代谢粗提物能够特异性地抑制胃癌细胞系AGS的生长,而不影响胃正常上皮细胞系GES的生长。通过对Geobacillussp.E263的代谢粗提物进行半制备型高效液相色谱分离,我们纯化得到一个能特异性抑制胃癌细胞系AGS生长的代谢物,气相色谱-质谱分析表明纯化到的活性物质可能是一种新的化合物。本论文围绕嗜热细菌(Geobacillussp.E263与其嗜热噬菌体GVE2在蛋白和代谢物水平上的相互作用关系展开研究。首先通过研究噬菌体编码的endolysin蛋白和宿主菌的ABCtransporter蛋白的相互作用关系,阐述了在高温条件下噬菌体裂解宿主菌的分子机制。其次,我们研究了细菌骨架MreB在GVE2侵染中的作用。最后,我们探寻了从深海热液口微生物中开发生物资源的可能性,我们通过代谢组学方法研究了Geobacillussp.E263在GVE2感染和未感染条件下的代谢谱图,获得27个与GVE2感染关的代谢物。由于噬菌体能够通过裂解宿主菌来影响热液口生态系统,因此本文的研究结果对理解噬菌体在深海热液口生态系统中的作用方面具有重要的意义,本文在深海热液口生物资源研究方面的工作有助于今后对热液口生物资源的进—步研究与利用。
【作者】金敏；
【导师】章晓波；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】嗜热微生物；噬菌体；裂解机制；MreB；海洋生物资源；代谢物；

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