基因重组血管生长抑制剂Kringle5与小分子物质相互作用研究

【摘要】目前,利用血管生成抑制类药物来抑制血管新生已经成为治疗肿瘤等血管新生类疾病的重要思路和方向。在目前所发现的血管生成抑制类因子中,人纤溶酶原的第五个环饼区,即Kringle5,是目前发现的抑制血管内皮细胞增殖作用特异性较高,毒副作用较小,且活性较强的抑制血管新生类物质,因此,Kringle5在肿瘤等血管新生类疾病的临床治疗方面具有巨大的潜力和应用价值。本工作将光谱法、亲和色谱法等实验方法以及分子对接、热力学和动力学模拟等理论预测方法相结合,研究了变性剂诱导的基因重组血管生长抑制剂Kringle5的结构变化过程以及一些小分子配体与血管生长抑制剂Kringle5之间的相互作用,为阐明血管生长抑制剂Kringle5的作用机理以及进一步对其药理药效的调控提供了一些新的视野。1.综合利用内源荧光光谱法、荧光相图分析、荧光探针以及荧光猝灭等方法监测表征了血管生长抑制剂Kringle5在盐酸胍和脲诱导下的展开-重折叠过程中的结构变化特征。结果显示,在盐酸胍和脲诱导的Kringle5的去折叠和重折叠过程中均不存在折叠中间态,即]Kringle5的去折叠和重折叠过程均符合“二态模型”。在盐酸胍和脲诱导的去折叠过程中,蛋白质分子内部的疏水区域逐渐暴露,暴露在蛋白表面的能被猝灭剂猝灭的荧光基团占总荧光基团的比例分别由59.2%上升至85.5%和由59.2%上升至83.3%；在盐酸胍和脲诱导的Kringle5重折叠过程中,蛋白分子内部重新形成疏水区域,暴露在蛋白表面的能被猝灭剂猝灭的荧光基团占总荧光基团的比例分别由88.3%下降至60.2%和由84.1%下降至61.1%。由本部分实验初步推测盐酸胍和脲诱导的Kringle5的去折叠和重折叠过程分别是经由同一路径的相互可逆的反应过程。2.利用光谱法、分子模拟对接技术并辅以热力学、动力学预测方法研究了不同温度下Kringle5与五种小分子配体(L-赖氨酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、氨甲环酸以及苄胺)的相互识别过程以及二者在相互作用过程中的作用状态、作用强弱、结合位点、作用力类型、作用距离以及作用过程中的热力学和动力学参数,同时研究了Kringle5分子内氨基酸残基和小分子配体中官能团的分布和对接。结果发现,Kringle5与五种配体之间的猝灭反应速率常数Kq均大于2×1010L·mol-1·s-1,且猝灭速率常数KSV均随着实验温度的升高而减小,表明Kringle5与五种配体间均由于形成了不发荧光的络合物而产生了静态猝灭现象；测定了不同温度下Kringle5与五种小分子配体的结合常数与结合位点数,发现Kringle5与五种配体的作用强度由强至弱的顺序为：氨甲环酸>6-氨基己酸>苄胺>7-氨基庚酸>L-赖氨酸；通过计算获知Kringle5与五种配体相互作用过程中的吉布斯自由能变、焓变、熵变以及表观活化能均为负值,说明Kringle5与五种配体都是以氢键和范德华力为主要作用力的自发的、放热的反应过程且反应过程中不存在能垒；利用Forster非辐射能量转移理论获知五种配体均同Kringle5分子发生了非辐射能量转移且与Kringle5分子中色氨酸残基的平均作用距离相差不大；通过分子模拟对接技术发现,五种配体与Kringle5分子的结合成键情况各不相同：氨甲环酸与Kringle5分子结合形成了两条氢键以及一个阳离子-π互作用,6-氨基己酸与Kringle5结合形成了两条氢键以及一个阳离子-π相互作用,苄胺与Kringle5结合形成了一条氢键,一个苯环-苯环共轭相互作用以及两个阳离子-π互作用,7-氨基庚酸与Kringle5结合形成一条氢键以及一个阳离子-π相互作用,L-lysine与Kringle5结合形成一条氢键一个阳离子-π相互作用；最后,在对比五种小分子结构差异的基础上,探讨了Kringle5蛋白更为偏向的配体分子的结构类型。3.利用亲和色谱技术,通过重氮盐反应将Kringle5蛋白键合到了硅胶基质上,并初步建立了一套利用亲和色谱的方法来研究Kringle5与小分子配体相互作用的实验方法。结果显示,将Kringle5键合到硅胶基质上后,色谱柱分离情况良好；经过前沿色谱分析所得到的Kringle5与五种小分子配体相互作用过程的结合常数与通过光谱法得到的结合常数数量级相同且作用强弱排序一致。说明该方法可以用于研究Kringle5与配体分子间的相互作用,并为进一步研究奠定了方向与基础。
【作者】冀旭；
【导师】边六交；
【作者基本信息】西北大学，中药生物工程，2014，博士
【关键词】血管生长抑制剂Kringle5；相互作用；构象变化；变性剂；配体；

【参考文献】
[1]马鑫.建国初期河北省宣传贯彻婚姻法运动研究[D].中共中央党校,中共党史,2013,硕士.
[2]孙文静.“给我”祈使句研究[D].山东大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[3]宋子龙.国企高管超额薪酬与薪酬操纵研究[D].长安大学,会计学,2014,硕士.
[4]黄国华.从知假买假行为的性质看《消费者权益保护法》的完善[D].西南政法大学,经济法学（专业学位）,2012,硕士.
[5]曹宗宏,张成堂,赵菊.库存水平影响需求且价格和存储费用可变的供应链协调模型[J].统计与决策,2014,21:46-49.
[6]胡珺.IPTV技术分析和济南联通解决方案[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[7]杨培.大众传播媒介对粉丝亚文化的再现[D].苏州大学,新闻学,2013,硕士.
[8]韩玉杰.石墨烯复合材料的制备及其在生物检测中的应用[D].复旦大学,2012.
[9]杨安其.汉语语言特点与英汉带稿同传中的长句处理[D].上海外国语大学,翻译,2014,硕士.
[10]王亚军,吴丹,陈健初,叶兴乾,刘东红.啤酒工业废水回用技术研究进展[J].工业水处理,2014,04:5-9.
[11]王雪冬.基于EEAC方法的电网脆弱性评价研究[D].华北电力大学（北京）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[12]李洪莲.丹参素对帕金森小鼠运动障碍的影响及机制研究[D].烟台大学,食品加工与安全,2014,硕士.
[13]屠闻文,雷建平,鞠熀先.卟啉纳米组装与生物传感[J].化学进展,2011,10:2113-2118.
[14]杨茜.盾构隧道纵向不均匀沉降及实时监测方法研究[D].北京交通大学,2013.
[15]朱富林.陇中南方言语音调查研究[D].陕西师范大学,汉语言文字学,2014,博士.
[16]吕龙源.中国当代时装设计中图案的作用及应用研究[D].西南大学,美术学,2014,硕士.
[17]吕江超.锥束CT系统的几何校正研究[D].河北大学,光学工程,2014,硕士.
[18]穆晓平.多自由度非线性随机滞回系统的响应分析[D].吉林大学,固体力学,2004,硕士.
[19]葛少云,李慧,刘洪.基于加权Voronoi图的变电站优化规划[J].电力系统自动化,2007,03:29-34.
[20]蔡志辉.低铝低硅TWIP钢的组织与性能研究[D].东北大学,材料加工工程,2011,硕士.
[21]陈闯.天津市科技型中小企业融资体系构建与整合[D].天津财经大学,金融学,2012,硕士.
[22]叶雪梅.幼儿教师媒介素养研究[D].西南大学,学前教育学,2014,硕士.
[23]梁毅辰,谷良贤,胡寒栋.基于AdamsSimulink的电机丝杠式偏转驱动机构控制系统设计与仿真[J].计算机与现代化,2014,04:215.
[24]车宝晶.当代大学生价值观构建中的美学思考[D].沈阳师范大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[25]高湛茱.新闻发布会交替传译的语义转述研究[D].南昌大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[26]徐晓光.氮肥与不同耕播方式对小麦群体质量和产量影响的研究[D].安徽农业大学,草业科学,2012,硕士.
[27]于凌宇.全球片式电容器面面观(之三)[J].世界产品与技术.2000(03)
[28]肖山.非焊合区对钛合金层合结构断裂性能影响分析[D].大连理工大学,工程力学,2013,硕士.
[29]张昌骐.做好归档工作是科技人员的职责[J].档案工作.1989(03)
[30]于博涛.交变载荷下乳化液泵曲轴有限元分析研究[D].西安科技大学,机械工程,2013,硕士.
[31]张倩.葡萄根系抗寒性研究[D].河南科技大学,果树学,2013,硕士.
[32]赵凤,王铁男,张良.多元化战略对企业绩效影响的实证研究[J].中国软科学,2012,11:111-122.
[33]顾纯俊.财政分权下地方政府“土地财政”规模估算及其成因分析[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[34]王丹.甲状腺形态超声测量及良恶性结节的声像图特征[D].大连医科大学,人体解剖与组织胚胎学,2012,硕士.
[35]刘文聪.小半径曲线大跨连续刚构桥受力特性研究[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[36]郭伟.拉萨证券营业部的绩效管理体系的研究与设计[D].四川大学,工商管理,2003,硕士.
[37]高兰昌.应用于环境光催化的几种含硫四氮杂卟啉的合成、表征和性能初探[D].中南民族大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[38]郑欢.古建筑保护与可持续旅游发展研究[D].安徽大学,旅游管理,2013,硕士.
[39]娜仁高娃.隧道地质灾害风险评估及超前地质预报方法研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[40]刘植惠.知识基因理论新进展[J].情报科学,2003,12:1243-1245.
[41]李聪.双连梁与等效刚度模型的有限元对比分析[D].北京建筑大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[42]陈遵德.自动空校中拟合曲面选取方法[J].石油地球物理勘探,1996,S2:118-120+127-152.
[43]周晶晶.新型战略背景下我国会计师事务所内部治理研究[D].兰州理工大学,会计学,2012,硕士.
[44]姜洲.微电影营销研究[D].黑龙江大学,新闻与传播,2013,硕士.
[45]赵方.淀粉接枝共聚物水煤浆分散剂的制备及性能研究[D].陕西科技大学,应用化学,2013,硕士.
[46]刘珩,潘景铭,唐小我.信息不对称时有损失厌恶型零售商参与的价格补贴契约设计[J].控制与决策,2011,01:111-114+119.
[47]李莹莹.金属酞菁/La_(0.8)Ce_(0.2)NiO_3复合催化剂的制备及光催化氧化DBT研究[D].西北大学,无机化学,2014,博士.
[48]齐娜.三聚氰胺分子印迹吸附和分离材料的制备与应用[D].河南科技学院,农产品加工及贮藏工程,2012,硕士.
[49]何小军.大跨连续刚构桥静动力计算分析和长期下挠问题探讨[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[50]李景贵.煤层气地面集输泄漏扩散模拟及风险评价研究[D].中国矿业大学,地球信息科学,2014,硕士.