水稻OsSPX4蛋白调控磷中心调控因子OsPHR2的机制研究

【摘要】拟南芥(Arabidopsisthaliana)中系统磷信号与磷平衡受中心调控因子AtPHRl及其部分功能互补的家族成员AtPHLl调控,它是一类具MYB-CC结构域的转录因子。AtPHRl在植物中具有功能的保守性,它在水稻中的同源基因OsPHR2是水稻调控缺磷胁迫响应的中心转录调控因子。前期研究发现,水稻体内有6个仅包含SPX结构域的蛋白,除了OsSPX4之外,其余5个基因均受缺磷诱导表达,推测OsSPX4蛋白同其它OsSPX蛋白相比具有不同的功能机制。水稻spx4突变体中,植株地上部分磷积累,缺磷响应基因表达显著上调。反之,在OsSPX4的过表达植株OxSPX4中,缺磷响应基因表达受到抑制。通过分析OsSPX4与OsPHR2双过表达材料(记为OxSPX4/OxPHR2),发现在双过表达材料中,OxSPX4回复了OxPHR2材料在正常磷条件下地上部磷积累和磷信号上调的表型,使磷浓度和磷信号回复到了野生型水平,表明OsSPX4具有负调控OsPHR2功能的作用。分析OsSPX4p-OsSPX4-GUS和OsSPX4p-OsSPX4-GFP转基因融合材料显示,OsSPX4蛋白在缺磷条件下,蛋白量显著下调。同时,在体内缺磷条件下OsSPX4蛋白的半衰期显著变短,表明缺磷条件加速OsSPX4蛋白的降解。利用体外降解体系,对GST-SPX4蛋白的体外稳定性进行检测,结果表明缺磷条件下GST-SPX4蛋白的降解加快,半衰期变短。但体外添加10mM和25mM磷酸盐(NaH2PO4,Pi)以及25mM亚磷酸盐(NaHPO3,Phi)时,GST-SPX4蛋白的稳定性有较大程度提高。与此同时,体外添加N(NaNO3)和S(Na2SO4)对GST-SPX4蛋白的稳定性没有影响,说明Pi提高OsSPX4蛋白的稳定性具有特异性。利用酵母双杂交以及免疫共沉淀等技术研究表明OsSPX4与OsPHR2可在体内和体外进行互作,OsSPX4中包含有SPX结构域的N端,以及OsPHR2中包含有MYB和CC结构的C端是两个蛋白的互作结构域。通过染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,Chip)以及凝胶阻滞电泳(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)进行体内和体外分析发现,OsSPX4蛋白通过与OsPHR2的互作,影响OsPHR2与其下游结合基因启动子的P1BS(PHR1BindingSequence)元件的结合。采用双分子荧光互补技术(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)确定了OsSPX4与OsPHR2互作的主要亚细胞部位是在细胞质中,但细胞核中也有互作信号。将35S-OsPHR2-mCherry和35S-OsSPX4-GFP融合基因共转入水稻原生质体中进行观察,发现同对照(35S-OsPHR2-mCherry和35S-GFP共转入水稻原生质体)相比,OsPHR2-mCherry的主要荧光信号在细胞质中,而对照组的OsPHR2-mCherry信号主要在细胞核中。表明OsSPX4对OsPHR2进入核内具有阻碍作用。进一步分析转基因材料OsPHR2p-OsPHR2-FLAG、OsPHR2p-OsPHR2-FLAG/spx4和OsPHR2p-OsPHR2-FLAGIOxSPX4,表明在spx4突变体的条件下,OsPHR2-FLAG蛋白在细胞质和细胞膜中的蛋白丰度都高于野生型,但在细胞核中具有极显著的提高。在OxSPX4过表达的材料中,同野生型相比细胞质中蛋白的丰度没有显著变化,但细胞核中的OsPHR2-FLAG蛋白的丰度显著降低。结果进一步证明了细胞水平的结果,即OsSPX4影响OsPHR2在细胞核中的亚细胞定位。综上所述,OsSPX4与OsPHR2在细胞质与核内互作,进而负调控OsPHR2功能。OsSPX4在蛋白水平响应缺磷信号。在细胞缺磷状况下OsSPX4蛋白通过蛋白降解途径降解,从而增强OsPHR2进核并与其顺势作用元件P1BS结合,启动其下游基因响应缺磷信号及提高磷的吸收能力。本研究结果为植物磷信号与磷平衡中心调控因子OsPHR2功能的调控机制提供了新的知识。植物磷信号与磷平衡中心调控因子在植物中具有保守功能已经有普遍报道,如拟南芥中的AtPHR1与AtPHLl,以及其他作物如小麦等。因此,本研究的发现在植物磷信号与磷平衡机制研究中具有普遍意义。
【作者】王宇光；
【导师】吴平；
【作者基本信息】浙江大学，植物学，2014，博士
【关键词】水稻(OryzasativaL.)；OsSPX蛋白；磷平衡；磷信号；蛋白降解；

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