酸马奶传统发酵过程的宏转录组学分析及细菌群落结构动态变化研究

【摘要】中国马业正处在从传统马业向现代马业转型的过渡期,而产品马业发展是现代马业的重要组成部分,包括马肉、马奶、马血、马尿等天然、绿色、营养、保健等高附加值的马产品开发。马乳产品,尤其是酸马奶的开发利用拥有广阔的发展前景。酸马奶在我国有2000年的历史,不仅必需脂肪酸、不饱和脂肪酸含量高,宜于人体消化吸收,还具有降血压,降血脂,治疗肺结核、贫血、心血管疾病及消化道疾病等医药保健价值,非常符合现代人的消费需求。然而,对酸马奶的大量研究中缺乏对其传统发酵过程的关注。了解发酵过程中酸马奶微生物的群落结构与功能基因表达的动态变化,可以优化群落结构、调整群落功能具有重要意义,还能为酸马奶食品安全、临床应用、改进传统发酵的可控性等研究提供理论依据。本研究以3.5L体系进行酸马奶发酵,每隔2.5h捣拌300次,一天共捣拌1500次,发酵温度保持在22±2℃范围内,以此条件发酵96h,每隔12h取一次样品为后续研究做准备。首先对各时期的酸马奶样品进行部分生理生化指标测定分析,初步了解发酵过程中的变化情况；其次,从发酵过程中选取六个时期的样品,提取宏基因组DNA,PCR扩增16SrDNA进行454焦磷酸测序,从而分析发酵过程中细菌群落结构演替变化；最后,选取发酵过程中的12h、48h和96h三个样品进行RNA-Seq高通量测序,构建酸马奶宏转录组文库,分析了解在发酵过程中功能基因表达情况。主要研究结果如下：1.酸马奶发酵过程中pH值为下降趋势,发酵前期变化差异显著,最低达到3.54；总蛋白质、脂肪、氨基酸、脂肪酸含量发酵过程中均有增长趋势,到72h达到最高值；发酵过程中乳糖含量减少,而乳酸含量增加。葡萄糖、半乳糖、乙酸、丙酸含量在发酵过程中处于较低的水平。丁酸在各个时期都未检测到。2.酸马奶在发酵的初期细菌多样性最高,随着发酵下降；细菌的丰度最高值在发酵的72h时出现。3.硬壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为酸马奶中的优势细菌门。发酵过程中,12h、24h和48h的硬壁菌门含量呈现出上升的趋势,而72h和96h时其含量又呈现出下降的趋势：变形菌门的细菌变化呈现出相反的趋势。4.在酸马奶制作过程中乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)为其优势细菌属。随着发酵时间的延长,12h、24h乳杆菌属(Lactobacillus)的含量呈现出上升的趋势,而72h和96h时其含量又呈现出下降的趋势；乳球菌属(Lactococcus)随着发酵含量呈现上升的趋势；在发酵的后期,醋酸菌属(Acetobacter)的含量呈现出增加趋势。5.进行酸马奶三个发酵时期(12h、48h、96h)宏转录组高通量测序,获得了12.2G的高质量短序列,组装出64.210个merge-Unigenes,其中59,339条Unigenes可以直接确定其CDS区及序列方向。其余序列用ESTscan软件进行编码区预测,有2,230条Unigenes可能为新的蛋白编码序列。6.对merge-Unigenes的GO功能分类分析结果显示,发酵过程与metabolicprocess、catalyticactivity及cellularprocess等密切相关；通过COG功能分类结果显示,酸马奶的发酵过程中,参与Aminoacidtransportandmetabolism的相关基因和replication,recombinationandrepair的相关基因起到了关键的调控作用;KEGG代谢通路分析,在发酵过程中Metabolicpathways.Biosynthesisofsecondarymetabolites及Microbialmetabolismindiverseenvironments通路是主要的信号通路。7.差异表达基因GO功能富集分析结果显示,发酵初期到发酵中期,metabolicprocess、cellularprocess、organicsubstancemetabolicprocess是主要的生物学过程,同时与organiccycliccompoundbinding、heterocycliccompoundbinding、smallmoleculebinding等分子功能基因表达活跃；自发酵中期到发酵末期,cellularprocess、cellularmacromoleculemetabolicprocess、single-organismcellularprocess等生物学过程相关基因起到决定性作用,structuralmoleculeactivity、structuralconstituentofribosome、proteinbinding等分子功能相关基因表达活跃。8.差异表达基因KEGGpathway富集分析,发酵初期到发酵中期,ibosomepathways是这一时期的主导代谢通路；自发酵中期到发酵末期,Etherlipidmetabolism、Aminobenzoatedegradation、Steroidbiosynthesis、mRNAsurveillancepathway等代谢通路发生主要作用。本研究通过高通量测序及数据分析,不仅揭示了酸马奶发酵过程中细菌群落结构变化,还建立了较为全面的酸马奶宏转录组数据库,丰富了酸马奶微生物在基因水平及蛋白水平上的数据信息,为进一步研究酸马奶的发酵过程中的基因结构和功能的变化以及代谢通路的调控等提供理论依据,对酸马奶资源的开发和利用具有重要意义。
【作者】布仁其其格；
【导师】芒来；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】酸马奶；传统发酵；16SrDNA；细菌群落结构；宏转录组；

【参考文献】
[1]高士超.美国思想库对政府越战政策形成过程的影响[D].黑龙江大学,国际政治,2013,硕士.
[2].今年5月浙江大学召开开放教育资源与教学改革国际研讨会[J].现代远程教育研究,2014,02:61.
[3]胡涛.高校社团对大学生公民意识养成的影响研究[D].西南大学,教育学原理,2014,硕士.
[4]孙雅青.基于资源基础理论的开源社区成长机制研究[D].山东财经大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[5]印久青.经济报道中如何运用好经济数据[J].数据,2005,08:42-44.
[6]王泽龙.静电纺丝纤维膜材料的制备及增强增韧[D].武汉工程大学,2014.
[7]冉宇瑶.证券数据仓库在证券业的应用及其结构[J].计算机工程与设计,2004,08:1379-1380+1383.
[8]严蓉.P集团生产执行系统整合研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[9]毛建忠,吴智铭.基于准时生产制的Job—Shop成组调度方法[J].控制与决策,1995,05:411-416.
[10]李鹏.不同选择策略的人工植物算法[D].太原科技大学,系统工程,2014,硕士.
[11]胡昌晨,魏良明,李晓琳,鲁得泂.S/TiO_2纳米复合材料在锂硫电池中的应用[J].微纳电子技术,2015,01:20-24+36.
[12]樊霄鹏.基于一体化集成框架的城乡规划信息系统的研究和应用[D].南京理工大学,计算机技术,2013,硕士.
[13]黄冠.武昌起义前孙中山的报刊活动研究[D].湖北大学,新闻学,2011,硕士.
[14]俞笑竹.新型半导体材料的制备及性能研究[D].上海交通大学,2012.
[15]刘飞.石涛绘画美学思想与山水画创作之间的关系[D].鲁东大学,美术学,2013,硕士.
[16]戴冰.机动车强制责任保险的第三人直接请求权研究[D].中国政法大学,民商法学,2012,硕士.
[17]彭静静.论萨特“存在主义是一种人道主义”思想[D].辽宁大学,外国哲学,2012,硕士.
[18]王阿鸣.石墨烯基纳米复合材料的制备及光电性质研究[D].安徽大学,2014.
[19]崔平远.梅森公式在多回路控制系统中的应用[J].自动化学报,1985,02:222-223.
[20]李文静.我国劳动密集型外商投资企业向外转移研究[D].华中师范大学,世界经济学,2013,硕士.
[21]刘彦会.基于SVM和RVM的加热炉钢温建模方法研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[22]宋海礁.复杂情况下的运动目标检测[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[23]侯广平.迈农的对象理论到胡塞尔的连续统理论[D].华东师范大学,外国哲学,2013,硕士.
[24]陈涛.视频扫描格式转换算法设计及其芯片实现[D].浙江大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[25]卜琳华,安实,付强.基于高等院校主导的协同创新模式研究[J].科技进步与对策,2012,22:40-43.
[26]陈海曼.基于提升小波的双重数字音频水印算法的研究[D].东北石油大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[27]张丽美.利用菌糠生产益生菌制剂适宜发酵条件的研究[D].东北农业大学,动物营养与饲料科学,2013,硕士.
[28]刘煜松.CS公司设计人员激励机制研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[29]楚振龙.中学物理教学中学生提出问题能力培养研究[D].东北师范大学,教育,2003,硕士.
[30]陈玉坤.国内发行赛马彩票的影响因素及对策[D].南京体育学院,体育人文社会学,2013,硕士.
[31]盛子烨.基于基片集成波导谐振腔微扰法测量微波介质磁导率的方法研究[D].南京邮电大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[32]林晓星.建筑物外立面泛光照明光污染防治[D].华侨大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[33]王明秀.益气养阴活血法治疗糖尿病合并冠心病的临床疗效观察[D].成都中医药大学,中西医结合临床医学,2012,硕士.
[34]刘莎莎.数据仓库在财务分析中的应用[D].东北财经大学,2005.
[35]许雯.基于分布式蜜罐的云端安全机制研究[D].江苏科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[36]张汝群,钟剑,郭兵.微机计轴道口信号设备[J].铁道通信信号.2002(08)
[37]李何鹏.长春市服务外包产业发展研究[D].吉林大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[38]彭雯秀.研究生教育服务质量容忍区域的实证研究[D].西南交通大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[39]杨萌,李强,彭永明,马呈祥.30t轴重电力机车转向架构架的静强度与疲劳强度分析及模态分析[J].铁道机车车辆,2014,03:18-22.
[40]李腾.重组大肠杆菌生产胸腺素β4的工艺研究及活性鉴定[D].天津大学,生物化工,2013,硕士.
[41]吴雨霖.突发性群体事件中县级政府舆情应对问题研究[D].湖南师范大学,政治学理论,2014,硕士.
[42]丛小舟.日内瓦学派的“批评意识”理论[D].黑龙江大学,美学,2013,硕士.
[43]唐宇峰.面向全局视觉机器鱼的多目标跟踪系统的研究与实现[D].华东交通大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[44]孙婷婷.近十年高考作文命题研究[D].渤海大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[45]叶秀娣.JY汽车美容企业人力资源管理现状及对策研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[46]周斌香.部分线性模型的基于拟似然函数的经验似然估计[D].湖南师范大学,概率论与数理统计,2014,硕士.
[47]杨春.寿光市粮食补贴政策的实施效应及其完善途径[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[48]孙立志.联合脱硫脱氮法治理石油化工烟气[D].大连海事大学,环境工程,2013,硕士.
[49]王萌.“微博依赖”实证研究基于河北省保定市大学生的问卷调查[D].河北大学,新闻与传播,2014,硕士.
[50]曹风雷.纳米管材料的化学修饰及其导电性质的理论研究[D].中山大学,2010.