内蒙古地区奶牛临床型子宫内膜炎致病葡萄球菌超抗原基因分布、耐药性及分型研究

【摘要】临床型奶牛了宫内膜炎是奶牛产后常见的产科疾病,可导致奶牛繁殖能力下降甚至不孕症的发生。内蒙古自治区是奶牛养殖大省,奶牛存栏量居全国前列,但该病给本地区奶牛养殖业带来了较为严重的经济损失。葡萄球菌是引起该病发生的主要条件性病原菌之一,其产生的超抗原毒素与炎性疾病的发生、发展相关。治疗由致病葡萄球菌引起的兽医临床感染疾病通常采用抗菌药物疗法,但由于奶牛场兽医临床普遍存在抗菌药物不合理使用现象,导致奶牛源致病葡萄球菌产生了较为严重的耐药性。因此,开展奶牛源致病葡萄球菌的抗菌药物耐药性调查和监控研究,对了解和阐明其耐药性的产生机理和流行扩散现状具有重要意义。此外,治疗奶牛细菌感染性疾病时,由于不同地区,不同养殖场在抗菌药物的选择和使用方面存在差异,造成奶牛源致病葡萄球菌的耐药特点也存在地区性差异。因此,开展不同地区奶牛源致病葡萄球菌耐药现状调查研究,可为不同地区奶牛场治疗由致病葡萄球菌引起的感染性疾病抗菌药物的选用提供科学依据。本研究通过开展内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎葡萄球菌的种群分布及超抗原毒力基因在菌株中的流行、分布情况调查,探讨葡萄球菌在该病发生、发展过程中潜在的致病作用；在此基础上进一步开展临床分离葡萄球菌对常用抗菌药物的耐药表型和分子耐药机理研究,考察内蒙古不同地区奶牛源葡萄球菌的耐药现状和耐药性产生的原因,可为兽医临床科学、合理的治疗该病提供用药方案；此外,通过开展内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎金黄色葡萄球菌的spa基因分型研究,阐明内蒙古不同地区奶牛源金黄色葡萄球菌中主要流行的spa基因型别及是否存在流行病学相关性,可为筛选本地区金黄色葡萄球菌疫苗候选菌株和控制由金葡菌引起的奶牛感染性疾病奠定理论基础。(1)采用常规细菌分离方法和gap基因PCR及测序法对内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎病料中的葡萄球菌进行了分离和种水平鉴定。结果表明,从采集自内蒙古不同地区的260份病料中,共分离到127株10种不同的葡萄球菌,分离率为48.8%。其中金黄色葡萄球菌53株,凝固酶阴性葡萄球菌74株。各地区葡萄球菌,金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的分离率差异均不显著(p>0.05)。分离到的凝固酶阴性葡萄球菌共9种,其中腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)数量最多(38株/29.9%),其次为产色葡萄球菌(S.chromogenes)(22株／17.3%)。(2)采用PCR技术对临床分离菌种中15种超抗原基因的携带情况进行了调查。结果表明,除肠毒素基因see和seg检测结果为阴性外,其余基因均不同程度的分布于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中。其中新型肠毒素基因selj(49株／38.6%)检出率最高,其次为seln(39株/30.7%)和传统型肠毒素基因sec(27株/1.3%)基因。同时发现17种不同的超抗原毒力基因组合,携带sec+selj+seln基因型的菌株最为流行(21株/16.5%)。西部地区凝固酶阴性葡萄球菌的超抗原基因携带率显著高于中部地区(p<0.05)。(3)采用微量肉汤稀释法测定了19种兽医临床常的抗菌药物及组合对临床分离菌的MIC。结果显示,分离菌对p-内酰胺类抗菌药物的耐药率在57.6%-79.5%；对大环内酯类和四环素类抗菌药物的耐药率在40%-50%之间；分离菌对庆大霉素和3组抗菌药物组合的敏感性相对较高,耐药率仅为15%左右,所有菌株对万古霉素均敏感。共发现43株多重耐药菌(33.9%)。不同地区的分离菌株对氟喹诺酮类药物、克林霉素和庆大霉素的耐药率存在地区差异(p<0.05或p<0.01)。采用PCR法对红霉素、四环素和青霉素耐药菌株进行了分子耐药机理的研究。结果表明,由erm基因介导的红霉素作用靶点甲基化是本地区奶牛源葡萄球菌对红霉素产生耐药性的主要机制；由tetK基因介导的外排机制是四环素耐药菌产生抗性的分子机制；由blaZ基因介导的水解作用是引起该地区青霉素耐药菌株产生的主要分子机制。(4)采用头孢西丁纸片法和mecA基因PCR技术对分离菌株进行了甲氧西林耐药菌的筛选。结果表明,有22株凝固酶阴性葡萄球菌被鉴定为甲氧西林耐药葡萄球菌,未发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。采用多重PCR法对22株甲氧西林耐药葡萄球菌进行了SCCmec分型试验。结果显示,有20株菌被成功的分为3个型,分别为Ⅱ型(6株,13.6%),Ⅲ型(12株,54.5%),IVa型(2株,9.1%),有2株未能分型。内蒙古中部和西部地区MRS菌株中以Ⅲ型SCCmec为主,东部地区以Ⅳa型为主。Ⅱ和Ⅲ型SCCmec的MRS菌株在中部,西部和东部地区的中均有分布。22株甲氧西林耐药葡萄球菌均为多重耐药菌,其对青霉素、氨苄西林、克拉霉素和红霉素的耐药率极显著高于甲氧西林敏感葡萄球菌p<0.01),对头孢噻肟的耐药率显著高于甲氧西林敏感葡萄球菌p<0.05)。(5)采用PCR法对53株临床分离的金黄色葡萄球菌进行了spa基因分型试验。结果表明,有51株菌被分为10个不同的型别,2株菌未能分型。其中t518型菌株最流行(34.0%),其次为t189型(20.8%)。t518型金黄色葡萄球菌的分布最广泛,在5个不同地理区域的采样地点均有流行,其余型别的SA在1-3个采样点内分布。本研究得到的主要结论如下：(1)内蒙古地区奶牛临床型子宫内膜炎病料中,葡萄球菌分离率较高,且种群分布广泛,是引起本地区奶牛子宫内膜炎发生的主要病原菌之一(2)多种超抗原毒力基因基因广泛地分布于内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎不同种葡萄球菌中,且不同地区葡萄球菌中超抗原毒力基因的流行模式存在差异。(3)内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎葡萄球菌对兽医临床药用抗菌药物产生了较强的耐药性,这可能是导致内蒙古地区奶牛临床子宫内膜炎治疗失败的主要原因之一。(4)内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎葡萄球菌中存在甲氧西林耐药菌株的流行,其流行的SCCmec基因型为Ⅱ型,Ⅲ型,Ⅳa型。(5)内蒙古地区临床型奶牛子宫内膜炎金黄色葡萄球菌的spa基因型别呈多态性分布,t518型和t189型是主要流行的基因型。
【作者】赵俊利；
【导师】李培锋；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】奶牛临床型子宫内膜炎；葡萄球菌；超抗原基因；耐药性；SCCmec分型；spa分型；

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