香菇多糖的系统分析及抗肿瘤活性研究

【摘要】香菇是当今世上最早可人工种植的食用菌与第二最广泛的中国传统医学(中医)蘑菇全球市场。它具有重要的营养价值和药用价值。目前,已经从香菇中分离并鉴定出多种具有生物活性的物质,如酚类物质、麦角固醇、硒、香菇嘌呤和各种矿物质。近年来,从香菇的子实体、菌丝和菌核中提取的多糖被证实具有一系列的生物活性,如抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎、抗病毒、护肝、降血脂和降血糖等。将香菇的子实体分别用水提取(冷水和热水)和碱提取(1MNaOH)。水提物用乙醇纯沉(95%乙醇),碱提物先用盐酸中和(3MHC1),然后用截留分子量为3500Da的透析袋透析,最后用乙醇纯沉。冷水提取、热水提取和碱提取得到的三种粗多糖依次为CW-LEP(59%Glc,22%Gal,15%Man,1%Rha和2%GlcA),WPLE(77%Glc,11%Gal,7%Man,1%Fuc,2%Rha和2%GlcA)和APLE(88%Glc,3%Gal,7%Man和2%Rha)。冷水提取得到的粗多糖CW-LEP,分别用SepharoseCL-6B,SephadexG-200和SephadexG-75凝胶柱层析进行分离纯化,最后一共得到6种均一级份,依次为CW-LEP-Ⅰ-a(60%Glc,17%Gal,19%Man,2%GlcA和1%Fuc),CW-LEP-Ⅰ-b(50%Glc,16%Gal,27%Man,2%GlcA和4%Fuc),CW-LEP-Ⅱ-a(42%Glc,14%Gal,39%Man,4%GlcA和1%Fuc),CW-LEP-Ⅱ-b(66%Glc,7%Gal,21%Man和5%GlcA),CW-LEP-Ⅲ-a(48%Glc,31%Gal,15%Man,3%GlcA和3%Fuc)和CW-LEP-Ⅲ-b(61%Glc,23%Gal,11%Man,4%GlcA和1%Fuc)oCW-LEP-Ⅲ-b,CW-LEP-Ⅲ-a,CW-LEP-Ⅱ-b,CW-LEP-Ⅱ-a,CW-LEP-Ⅰ-b和CW-LEP-Ⅰ-a的分子量依次为5.9kDa,18.3kDa,77.0kDa,383.2kDa,584.8kDa和>2000kDa。因此,推测CW-LEP-Ⅰ-a,CW-LEP-Ⅰ-b.CW-LEP-Ⅱ-a.CW-LEP-Ⅱ-b.CW-LEP-Ⅲ-a和CW-LEP-Ⅲ-b可能分别是galactomannoglucan、fucogalactomannoglucan、glucuronogalactomannoglucan,glucuronogalactomannoglucanfucomannogalactoglucan和glucuronomannogalactoglucan类型的多糖。将热水提取的粗多糖WPLE依次用DEAE-纤维素阴离子柱层析梯度洗脱,冻融处理以及梯度乙醇纯沉(30%,50%,70%和90%)。进而将得到的不同多糖级分进行分离纯化和结构分析。水洗脱级分WPLE-N是由Glc-Gal-Man(79:15:6)构成的多糖,将其用SepharoseCL-6B凝胶柱层析分离纯化后,得到WPLE-N-1,WPLE-N-2和WPLE-N-3三种级份。GPC和HPGPC结果显示,这三种级份均为均一性多糖,分子量依次为757.5kDa,20.9kDa和4.7kDa。通过HPLC.甲基化、高碘酸氧化-Smith还原、FT-IR和NMR谱,包括2DNMR(HMBC和HMQC)等分析手段鉴定,结果显示,WPLE-N-1是一种glucan类型多糖,含有(1→6)-(β-D-Glcp残基,而WPLE-N-2和WPLE-N-3均是一种mannogalactoglucan类型的多糖,含有(1→6)-,(1→4)-和(1→3)-α-D-Glcp残基,(1→6)-α-D-GallP,(1→3,6)-和(1→2,4)-α-D-Manp残基以及D-Glcp末端。用0.5MNaCl梯度洗脱下来的级份WPLE-A0.5是由Glc-Gal-Man-Fuc-GlcA(摩尔比为49：31：15：4：1)构成的,将其上样于SepharoseCL-6B进一步分离纯化,得到的主要级份WPLE-AO.5-2是一种均一多糖,分子量为18kDa。通过化学分析和仪器分析,结果显示,WPLE-AO.5-2是一种mannogalactoglucan类型的多糖,主要含有(1→6)-,(1→4)-和(1→3)-β-D-Glcp残基,(1→6)-α-D-Galp残基,(1→3,6)-和(1→6)-a-D-Manp残基和β-D-Glcp末端。冻融分级中的上清级份S-WPLE由Glc(48.3%),Gal(24.0%),Man(20.1%),Fuc(2.8%).GlcA(2.0%),Rha(2.5%)和Xyl(0.2%)构成。分别用SepharoseCL-6B,SephadexG-100和SephadexG-75凝胶柱层析对S-WPLE进一步分离纯化,得到6种均一级份,依次为S-WPLE-Ⅰ-a、S-WPLE-Ⅰ-b、S-WPLE-Ⅱ-a、S-WPLE-Ⅱ-b、S-WPLE-Ⅲ-a和S-WPLE-Ⅲ-b,这些级分均主要由Glc-Gal-Man构成,摩尔比依次为98：1：1、91：5：4、88：4：8、74：16：10、79：14：7和70：14：11。这6种多糖S-WPLE-Ⅲ-b,S-WPLE-Ⅲ-a.S-WPLE-Ⅱ-b.S-WPLE-Ⅱ-a,S-WPLE-Ⅰ-b和S-WPLE-Ⅰ-a的分子量依次为7.5kDa、15.2kDa、23.6kDa、121.5kDa、755.32kDa和>2000kDa。甲基化结果显示S-WPLE-I-a含有(1→3)-,(1→4)-,(1→6)-,(1→3,6)-D-Glcp残基和D-Glcp末端,S-WPLE-I-b含有(1→3)-.(1→4)-.(1→6)-.(1→3.6)-D-Glcp,(1→6)-D-Galp残基,(1→6)-D-Manp残基和D-Glcp末端残基,S-WPLE-Ⅱ-a和S-WPLE-Ⅱ-b含有(1→3)-,(1→4)-,(1→6)-和(1→3,6)-D-Glcp残基,(1→6)-D-Galp残基,(1→2,4)-D-Manp残基和不同比例的D-Glcp末端,S-WPLE-Ⅲ-a含有(1→3)-,(1→4)-,(1→6)-和(1→3.6)-D-Glcp残基,(1→6)-D-Galp残基,(1→6)-,(1→2,4)-D-Manp残基和D-Glcp末端,S-WPLE-Ⅲ-b含有(1→3)-.(1→6)-和(1→3,6)-D-Glcp残基(1→4)-D-Galp残基,(1→3,6),(1→2.4)-D-Manp残基和D-Glcp末端。因此,可以推断,S-WPLE-Ⅰ-a和S-WPLE-Ⅰ-b是glucan类型多糖,S-WPLE-Ⅱ-a是galactomannoglucan类型多糖,S-WPLE-Ⅱ-b、S-WPLE-Ⅲ-a和S-WPLE-Ⅲ-b是mannogalactoglucan类型多糖。WPLE用梯度乙醇纯沉,分别用30%,50%,70%和90%纯沉,依次得到WPLE-E30,WPLE-E50,WPLE-E70和WPLE-E90四种级份。WPLE-E30和WPLE-E50主要由Glc(分别为970%和96%)构成。WPLE-E70andWPLE-E90均由Glc-Gal-Man-GlcA-Fuc构成,摩尔比分别为72：15：9：3：1和80：6：11：3：0。用SepharoseCL-6B凝胶层析柱对WPLE-E50进一步分离纯化,得到WPLE-E50-Ⅰ(96%Glc,2%Gal.2%Man),WPLE-E50-Ⅱ-a(86%Glc.3%Gal,11%Man)和WPLE-E50-Ⅱ-b(82%Glc.10%Gal.6%Man.2%Fuc)。基于以上HPLC结果.可以推测出WPLE-E50-Ⅰ是glucan类型多糖,WPLE-E50-Ⅱ-a是galactomannoglucan类型多糖,WPLE-E50-Ⅱ-b是mannogalactogiucan类型多糖。WPLE-E50-Ⅰ.WPLE-E50-Ⅱ-a和WPLE-E50-Ⅱ-b的分子量分别为>2000kDa,297.4kDa和9.1kDa。用SepharoseCL-6B和SephadexG-75凝胶柱层析对WPLE-E70进一步分离纯化,得到6种级份,分别为WPLE-E70-Ⅰ-a.WPLE-E70-Ⅰ-b(71%Glc,12%Gal,14%Man,2%GlcA,1%Fuc).WPLE-E70-Ⅱ-a(72%Glc,12%Gal,12%Man,2%GlcA,1%Fuc),WPLE-E70-Ⅱ-b(84%Glc,5%Gal,6%Man,4%GlcA,1%Fuc),WPLE-E70-Ⅲ-a(70%Glc,18%Gal,6%Man,3%GlcA,3%Fuc)和WPLE-E70-Ⅲ-b(74%Glc,14%Gal,6%Man,3%GlcA,3%Fuc)。因此,可以推测出,WPLE-E70-Ⅰ-b和WPLE-E70-Ⅱ-a是galactomannoglucan类型多糖,WPLE-E70-Ⅱ-b是glucuronogalactomannoglucan类型多糖,WPLE-E70-Ⅲ-a和WPLE-E70-Ⅲ-b可能均为glucuronomannogalactoglucan类型多糖。HPGPC检测结果显示WPLE-E70-Ⅰ-b,WPLE-E70-Ⅱ-a,WPLE-E70-Ⅱ-b,WPLE-E70-Ⅲ-a和WPLE-E70-Ⅲ-b的峰型均为单独和对称型,利用葡聚糖标准曲线算其分子量依次为475.4kDa,400.0kDa,95.1kDa.17.3kDa和6.8kDa。WPLE-E70-Ⅰ-a的峰型呈现不对称状,计算其分子量为1159.5kDa。用SepharoseCL-6B,SephadexG-150和SephadexG-50对WPLE-E90进一步分离纯化,得到6个级份,分别为WPLE-E90-Ⅰ-a(76%Glc,3%Gal,19%Man,2%GlcA),WPLE-E90-Ⅰ-b(52%Glc.25%Gal,21%Man,2%GlcA),WPLE-E90-Ⅱ-a(73%Glc,2%Gal,22%Man,3%GlcA),WPLE-E90-Ⅱ-b(82%Glc,4%Gal,11%Man,3%GlcA),WPLE-E90-Ⅲ-a(82%Glc,9%Gal,7%Man,2%WPLE-E90-Ⅲ-b(75%Glc,13%Gal,8%Man,1%GlcA,3%Fuc)。因此,WPLE-E90-Ⅰ-a,WPLE-E90-Ⅱ-a和WPLE-E90-Ⅱ-b可能是glucuronogalactomannoglucan类型多糖,WPLE-E90-Ⅰ-b和WPLE-E90-Ⅲ-a是glucuronomannogalactoglucan类型多糖,WPLE-E90-Ⅲ-b是fucomannogalactoglucan类型多糖。用HPGPC分别检测WPLE-E90-Ⅰ-a,WPLE-E90-I-b,WPLE-E90-Ⅱ-a,WPLE-E90-Ⅱ-b,WPLE-E90-Ⅲ-a和WPLE-E90-Ⅲ-b这6种级份,结果显示,6种级份均为均一级份,计算其分子量依次为442.6kDa,289.3kDa,135.6kDa,43.7kDa,8.4kDa和4.2kDa。碱提取得到的粗多糖APLE经冻融分级,得到2种级份,分别为I-APLE和S-APLE,I-APLE主要由Glc(97%)构成,S-APLE由Glc(91%),Gal(5%)和Man(4%)构成。冻融上清S-APLE为不均一级份,用SepharoseCL-6B对其进一步分离纯化,得到S-APLE-Ⅰ-a(96%Glc,4%Man),S-APLE-Ⅱ-b(93%Glc,7%Gal),S-APLE-Ⅲ(84%Glc,11%Gal,5%Man)和S-APLE-Ⅳ(71%Glc,16%Gal,13%Man)4种均一级份,其分子量依次为20.4kDa,68.5kDa,230kDa和2120kDa。因此,可以推测出,S-APLE-Ⅰ-a是mannoglucan类型多糖,S-APLE-Ⅱ-b是galactoglucan类型多糖,S-APLE-Ⅲ和S-APLE-Ⅳ是mannogalactoglucan类型多糖。最后,一共得到34种多糖级分,包括5种glucans类型多糖,1种galactoglucan类犁多糖,4种mannoglucan类型多糖,8种galactomannoglucan类型多糖和16种mannogalactoglucan类型多糖。体外活性检测(细胞毒性法)发现,WPLE-N-1,WPLE-N-2,WPLE-N-3,WPLE-A05-2,S-WPLE,S-WPLE-Ⅰ-a,S-WPLE-I-b,S-WPLE-Ⅱ-a,S-WPLE-Ⅱ-b,S-WPLE-Ⅲ-a和S-WPLE-Ⅲ-b在不同的浓度条件下(1,2,5mg/mL),对SarcomaS-180,CarcinomaHCT-116和HT-29肿瘤细胞都有一定的抗肿瘤活性,并且呈现浓度依赖性。分子量大的多糖似乎比分子量小的多糖活性好。另外,这些多糖级分对悬浮细胞(SarcomaS-180)比对粘附细胞(HCT-116andHT-29carcinomacells)表现出更高的抗肿瘤活性,具有一定的选择性。实验发现,Gal,Man和结合蛋白具有抗肿瘤增值活性。体内抗肿瘤实验结果显示,WPLE-N-1,WPLE-N-2和WPLE-AO.5-2三种多糖,在给药量为100mg/kg,连续给药10天的条件下,对Sarcoma180昆明小鼠实体瘤具有抗肿瘤作用,其中,mannogalactoglucan类型的多糖WPLE-N-2和WPLE-AO.5-2活性比glucan类型的多糖WPLE-N-1强。而且,体内实验结果显示,WPLE-N-1,WPLE-N-2和WPLE-A0.5-2能够显著地增加巨噬细胞的吞噬作用,诱导NO的释放,促进T淋巴细胞和B淋巴细胞增值以及促进肿瘤细胞凋亡。综上所述,香菇多糖为抗肿瘤和免疫调节药物的开发提供了一种崭新的思路。本研究发现,对于食品和制药工业,应该着重开发研究,在抗肿瘤和免疫调节活性方面具有较大潜力的mannogalactoglucan类型多糖,作为一种天然抗肿瘤药物。本论文为能更全面的了解香菇成分,特别是多糖,为更好解释香菇提取物的生物活性提供了多种有效数据。
【作者】ITEKUBEKOMOJEFF（杰弗）；
【导师】周义发；
【作者基本信息】东北师范大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】香菇；多糖；(1→6)-β-D-glucan；Mannogalactoglucan；分级；结构分析；细胞增殖；免疫调节活性；

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