梯度逆流色谱及相关联用技术在中草药分析中的应用研究

【摘要】论文属于分析化学专业，天然产物分析和色谱法分析方向。论文内容是以高速逆流色谱（HSCCC）技术为核心，建立梯度逆流色谱技术和加压液体萃取与高速逆流色谱联用技术，并对天然产物进行分离提取研究。由于HSCCC是一种“液—液分配”色谱技术，单次所分离的化合物极性均较接近，极性范围较窄，这也成为了逆流色谱的一个弊端。由于天然产物极性范围通常较宽，用传统HSCCC难以一次分离，因此，建立一套梯度逆流色谱技术，采用不同极性的溶液作为流动相，将极性范围较宽的化合物及组分洗脱下来。首先，利用超高效液相色谱和质谱联用技术（UPLC/MS）、超高效液相色谱/固相萃取核磁共振氢谱联用技术（UPLC/SPE/NMR）技术对罗布麻叶中化学成分进行鉴别。并建立四阶段梯度逆流色谱技术，利用梯度逆流色谱技术对罗布麻叶中化学成分进行系统分离。首先以正己烷—乙酸乙酯—乙腈—水（体积比：1.5:3.5:2:4.5）的下层溶液作为HSCCC固定相，以上层溶液作为流动相，洗脱亲脂性成分；将流动相更换为乙酸乙酯—乙腈—水（5:3:7）的上层溶液，洗脱中等亲脂行成分；将流动相更换为乙酸乙酯—甲醇—水（5:2:5）的上层溶液，洗脱中等亲水性成分，最后，将流动相更换为正丁醇—甲醇—水（5:1:5）的上层溶液，洗脱亲水性成分。利用该技术，于130分钟内洗脱16个化学成分，分别为加贯叶金丝桃素、贯叶金丝桃素、阿曼托双黄酮、I3-II8双芹菜苷元、槲皮素、萹蓄苷、乙酰化异槲皮素、乙酰化金丝桃苷、紫云英苷、三叶豆苷、异槲皮素、金丝桃苷、槲皮素–3–O–葡萄糖醛酸、芦丁、绿原酸和白麻苷。贯叶金丝桃是夹竹桃科植物，该植物的提取物直接暴露在空气中时，提取物中的间苯三酚类化合物容易和光及氧接触而降解。而用传统的分离提取方法分离天然成分时，化学成分大多会与空气接触。因此，用传统的方法分离提取贯叶金丝桃提取物具有一定的弊端。因此，寻找一种更加优化的分离提取方法从而使天然产物在提取和分离过程中均不需与空气接触进而提高天然产物产率的方法具有重要的意义。此外，贯叶金丝桃中咖啡酰奎宁酸是一类重要的活性成分，然而，三咖啡酰奎宁酸在药用植物中含量极低，用传统的方法对其进行分离提取所获得的产率极低。因此，寻找一种高效率的方法对其进行分离提取也具有重要的意义。因此，建立了加压液体萃取（PLE）和HSCCC联用技术。应用该技术从贯叶金丝桃中分离得到5个化合物。首先，以乙酸乙酯—甲醇—水（体积比：5:2:5）的上层溶液作为ASE的提取液提取贯叶金丝桃中亲脂性成分，提取液泵入至HSCCC色谱柱内。以该溶剂系统的上层溶液作为HSCCC的固定相，以下层溶液作为HSCCC的流动相，分离提取得到2个亲脂性成分，分别为贯叶金丝桃素和加贯叶金丝桃素。其次，以乙酸乙酯—甲醇—正丁醇—水（5:2:2.5:12）的下层溶液作为ASE的提取液提取贯叶金丝桃中亲水性成分，提取液泵入至HSCCC色谱柱内。以该溶剂系统的下层溶液作为HSCCC的固定相，以上层溶液作为HSCCC的流动相，分离提取得到3个亲水性成分，分别为3,4,5–O–三咖啡酰奎宁酸、1,3,5–O–三咖啡酰奎宁酸和3,O–三咖啡酰奎宁酸。三七是五加科植物，极性皂苷是主要成分，极性皂苷在高温下会水解，进而生成活性更强的弱极性皂苷。用PLE/HSCCC很难一次将极性范围较宽的化合物分离提取出来，因此建立了三阶段梯度ASE和HSCCC联用技术分离三七中皂苷类成分。以乙酸乙酯—正丁醇—水（1:1:2和1.2:1:2）、乙酸乙酯—正丁醇—甲醇—水（3:5:1.5:6）作为第一阶段溶剂系统，提取温度为60oC。以溶剂系统的上层溶液作为ASE的提取液和HSCCC固定相，下层溶液作为HSCCC流动相，分离提取三七中极性成分。分离提取得到3个极性皂苷。以乙酸乙酯—正丁醇—甲醇—水（6:3:2:6和7:3:2:7）作为第二阶段溶剂系统，提取温度为115oC。以上层溶液作为ASE的提取液和HSCCC固定相，以下层溶液作为HSCCC的流动相，分离提取三七中中等极性性成分。分离提取得到3个中等极性皂苷。以正己烷—正丁醇—甲醇—水（8:2:2:8）或正己烷—乙酸乙酯—正丁醇—甲醇—水（0.2:10:0.5:1.5:8）作为第三阶段溶剂系统，提取温度为135oC，以上层溶液作为ASE的提取液和HSCCC固定相，以下层溶液作为HSCCC的流动相，分离提取三七中弱极性性成分，分离提取得到3个弱极性皂苷。经上述三个ASE/HSCCC阶段，在400分钟内共分离提取到9个以上的皂苷类成分。分别为三七皂苷R6、R1、Spt1、人参皂苷Rb1、F4、Rh3、Rg3、Rs3和Rk1。在应用传统的HSCCC进行分离前，通常需准备若干个溶剂系统，检测目标化合物在溶剂系统中的分配系数（K值），进而通过化合物的分配系数筛选溶剂系统。然而，此方法具有一定的随机性和盲目性，而利用数学模型计算和优化溶剂系统中各溶剂比例具有一定的科学性。此外，由于高速逆流色谱溶剂系统通常含有正己烷、正庚烷、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂，尤其是氯仿和二氯甲烷等毒性较大，人体长时间和上述有机试剂接触会引发各类疾病，而高速逆流色谱在操作前，往往需要人工配置溶剂系统，导致大量的有机试剂和人体相接触。因此，建立一套自动溶剂系统装置以避免操作人员和试剂的接触具有重要的意义。且该方法在逆流色谱的工业化应用中具有重要的意义。因此，论文建立了数学模型优化三阶段梯度ASE/HSCCC溶剂系统的方法，分离人参和西洋参中皂苷类成分。首先，HSCCC溶剂系统需手工配置。用多元指数函数模型确定了溶剂系统中溶液的组成比例。以乙酸乙酯—正丁醇—水（1.1:1.0:2.1）、乙酸乙酯—正丁醇—甲醇—水（3.1:0.6:1.0:2.6）和正己烷—正丁醇—甲醇—水（4.2:1.0:1.2:4.5）作为三个阶段的溶剂系统，均以各溶剂系统的上层溶液作为ASE提取液和HSCCC固定相，以下层溶液作为HSCCC流动相。提取温度分别为60o、110oC和125oC，提取液进入HSCCC进行分离。经上述三个ASE/HSCCC阶段，在460分钟内共分离提取到9个目标人参皂苷，纯度均高于93.35%，同时分离得到2个非目标人参皂苷，纯度高于73.65%。其次，HSCCC溶剂系统自动配置。正庚烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水均由泵按照一定流速抽取，在溶剂分离瓶中进行配置。以乙酸乙酯、正丁醇和水按照流速分别为11.0，10.0和23.0ml/min进行配置，作为第一阶段溶剂系统，以乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水按照流速分别为20.0，3.0，5.0和11.0mL/min进行配置，作为第二阶段溶剂系统，以正庚烷、正丁醇、甲醇和水按照流速分别为17.5，6.0，5.0和22.5mL/min进行配置，作为第三阶段溶剂系统，三个阶段的提取温度分别为60o、110oC和125oC，均以上层溶液作为ASE提取液和HSCCC固定相，以下层溶液作为HSCCC流动相，分离提取化学成分。经上述三个ASE/HSCCC阶段，在460分钟内共分离提取到9个目标人参皂苷，纯度均高于95.0%，同时分离得到3个非目标人参皂苷，纯度高于84.48%。利用数学模型优化ASE/HSCCC溶剂系统并结合溶剂自动配置系统具有广泛的工业化应用前景。
【作者】张语迟；
【导师】郭黎平；刘春明；
【作者基本信息】东北师范大学，分析化学，2014，博士
【关键词】高速逆流色谱；加压液体萃取；数学模型；提取和分离；

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