使用木薯原料和外部代谢调控策略提高丁醇发酵的丁醇/丙酮比

【摘要】丁醇是重要的平台化合物，也是一种高效的清洁液态燃料。利用产溶剂梭菌（Clostridia）和生物质原料发酵生产丁醇受到人们越来越多的关注。在使用梭菌发酵生产溶剂过程中，溶剂产物丁醇、丙酮和乙醇的比例约为6:3:1（w/w）。在保证总溶剂生产效率不变或者提高的前提下，尽量提升主产品—丁醇占总溶剂的比例、或者丁醇/丙酮比，一直是研究者所追求的目标。另外，玉米、小麦等农产品受到种植条件的制约，使用上述生物质生产生物丁醇影响到了人类食物的供给安全。因此，亟需寻找廉价、对种植条件要求低的高产非粮原料作为替代原料生产生物丁醇。针对上述问题，本论文以丙酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824为实验菌株，以发酵途径关键酶基因转录水平测定和代谢通量计算为分析手段，以玉米和木薯为原料，在7L厌氧发酵罐下，开展丁醇发酵研究。论文提出了丁醇发酵的有效优化调控策略，并对使用不同原料下的发酵性能进行了比对研究，旨在提高丁醇/丙酮比、实现非粮木薯原料对传统玉米原料的有效替代、改善丁醇发酵的整体性能。主要结果总结如下：（1）研究和比较了以木薯和玉米为原料、传统和原位萃取发酵操作模式下的丁醇发酵性能。结果表明，木薯原料发酵的相转型（产酸相→产溶剂相）严重滞后、丁醇产量和生产效率低下，整体发酵性能无法达到玉米原料发酵的相应水平。通过一系列试行发酵实验最终发现，在以木薯为原料、油醇为原位萃取剂的萃取发酵中，发酵产气显著减弱后适时添加2.5g·L-broth–1酵母浸粉，发酵产气迅速回升、发酵相转型可在数小时内顺利完成，最终丁醇总产量达到35.38g·L-broth–1。（2）适时添加酵母浸粉（2.5g·L-broth–1）的优化调控策略，适用于以木薯为原料的多种丁醇发酵操作模式，可解除发酵相转型延滞、促进相转型的发生和完成。丁醇总产量分别达到13.61g·L–1（传统）、34.37g·L–1（油醇萃取）和18.37g·L–1（生物柴油萃取）。更加重要的是，以木薯为原料、辅以适时酵母浸粉添加的优化调控策略，可以大幅度提高丁醇发酵的丁醇/丙酮比。其中，油醇萃取发酵的丁醇/丙酮比可接近3.0:1，相比玉米原料、相同发酵操作模式下的水平提高了61.5%，整体发酵性能的改善更加明显。（3）分析测定了木薯原料丁醇发酵中，代谢途径的关键酶编码基因转录水平，发酵液中游离氨基酸的浓度及其变化。结果表明：适时添加酵母浸粉后，催化有机酸（乙酸、丁酸）吸收的辅酶A转移酶得到激活，其编码基因ctfAB的转录水平提高了约15倍；同时，菌体开始大量合成有利于丁醇生产的组氨酸族和天冬氨酸族氨基酸。两者共同作用，促进了木薯原料发酵的相转型、极大地提高了丁醇产量和生产效率。（4）在以木薯和玉米为原料进行发酵的条件下，利用代谢通量计算的手段、对碳代谢和还原力再生的最适匹配关系进行了分析，并对代谢途径中关键酶基因转录水平/中间产物进行了测定。结果表明：在木薯原料发酵产溶剂期，丁酸激酶基因buk和辅酶A转移酶基因ctfAB转录水平低、丁酸生成/吸收再利用闭环的代谢强度低；催化丁醇合成最后两步反应的NADH依存型关键酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的基因adhE和bdhB转录水平也低；但是，NADH再生速率水平高。高NADH再生速率和低丁酸闭环代谢强度共同作用，最终导致木薯丁醇发酵丁醇/丙酮比大幅提高。（5）分别以葡萄糖和酵母浸粉为碳氮源，探讨了不同碳氮配比对丁醇发酵相转型和丁醇/丙酮比的影响。结果发现，产酸期的碳氮比要控制在适中（46.7~93.4mol·mol–1）水平，此时，菌体能够正常生长、有机酸不过量生成，相转型可以顺利完成；产溶剂期的碳氮比保持在较高水平（≥93.4mol·mol–1）时，丁醇/丙酮比可达到3.0:1以上。以木薯为原料、在发酵转型期适时添加酵母浸粉的丁醇发酵优化调控策略的有效性和可靠性得到了进一步的实验验证。（6）依据理论分析结果，弱化丁酸生成/吸收再利用闭环的代谢强度有望提高丁醇发酵的丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率。为此，在使用木薯和玉米为原料进行传统丁醇发酵、发酵进入产溶剂期后，脉冲式地添加少量丁酸（总添加量3.0g·L-broth–1）或乙酸（4.0g·L-broth–1），期望达到提高丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率的目的。其中，添加少量丁酸的调控策略对玉米原料丁醇发酵最为有效，平均丁醇/丙酮比可以提高23%、从1.92上升到2.36:1；平均总溶剂生产效率也可以提高16%、从0.355g·L–1·h–1上升到0.410g·L–1·h–1。但是，上述调控策略对提高木薯原料丁醇发酵的性能没有明显效果，因为使用木薯原料进行丁醇发酵时，辅酶A转移酶活性低、丁酸闭环代谢强度已经很低，外添丁酸起不到降低丁酸闭环代谢强度的效果。
【作者】李鑫；
【导师】史仲平；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】代谢分析与调控；丁醇发酵；丁醇/丙酮比；非粮原料；基因转录水平；

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