半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选

半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选

作者:师大云端图书馆 时间:2015-08-27 分类:硕士论文 喜欢:1738
师大云端图书馆

【摘要】半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)是我国特有的优质海水养殖鱼类,其雄性个体比雌性个体小2到4倍,且生长速度也比雌性个体慢很多。另外,半滑舌鳎的性别决定系统为ZZ/ZW型,存在自然性逆转现象。这些原因都导致了在自然养殖条件下雄性比例过高,从而严重阻碍了半滑舌鳎养殖产业的进一步发展。为了提高后代雌性比例,在育种中我们尝试用半滑舌鳎伪雄鱼为父本,结果却发现伪雄鱼后代中的雌性比例并没有提高。因此我们检测了伪雄鱼精子的基因型,发现只有Z型精子而没有W型精子。结合半滑舌鳎基因组测序结果发现,W染色体虽然比Z染色体大很多,但携带的基因数目却远远少于Z染色体,所包含的遗传信息也少很多。本文对3个半滑舌鳎Z染色体特异的、与精子发生相关的基因进行了初步的研究,推测了这些基因在精子发生过程的功能,为揭示半滑舌鳎W型精子缺失的原因,及高雌乃至全雌育种提供理论依据。主要结果如下:1.克隆得到了半滑舌鳎tesk1全长cDNA序列和基因组序列。利用定量PCR检测了该基因的表达特征,结果表明:tesk1在半滑舌鳎精巢中的表达最高,在脑、肝脏、肾脏中有少量表达;在正常雄鱼和伪雄鱼精巢中表达,而三倍体雄鱼的精巢中不表达;在116天前几乎不表达,5个月开始表达,1年时表达急剧上升并达到最大。原位杂交结果表明,tesk1主要在半滑舌鳎精巢中的精子细胞和成熟精子中表达。因此我们推测,tesk1可能在精子形成阶段起作用。通过染色体原位杂交将该基因定位到了半滑舌鳎Z染色体上。通过GenomeWalking获得了部分上游调控序列,通过分析发现了HSF、SRY、C/EBP、CRE-BP等转录因子结合位点。甲基化分析表明,该基因的表达水平与甲基化水平没有关系。2.克隆得到了半滑舌鳎neurl3全长cDNA序列和基因组序列。利用定量PCR检测了该基因的表达特征,结果表明:在半滑舌鳎各组织中,精巢的表达量最高;在孵化后116天,开始大量表达并达到最高。原位杂交结果表明,neurl3主要在半滑舌鳎精巢中的精子细胞和成熟精子中表达。染色体原位杂交结果表明,neurl3位于半滑舌鳎Z染色体上。成功构建了原核表达载体,通过IPTG诱导,能够表达出大小符合预期分子量的蛋白。3.获得了半滑舌鳎strbp的全长cDNA序列和基因组序列,利用Real-timePCR检测了半滑舌鳎strbp在转录水平的表达情况。发现该基因主要在成熟半滑舌鳎的性腺中表达(精巢和卵巢都有表达),虽然在脑和脾脏中也检测到了该基因的表达,但与性腺相比要低很多。原位杂交结果表明半滑舌鳎strbp主要在精子细胞变态开始形成精子的阶段大量表达,可能在这一时期发挥一定的作用。大菱鲆(Scophthalmusmaximus)是从欧洲引进的优良海水养殖鱼类。频繁暴发的疾病严重影响了大菱鲆养殖产业的发展。使用药物能够减少疾病造成的损失,但药物不但使病原菌产生抗药性,更为重要的是,药物残留也会造成环境污染以及对人类健康造成威胁。因此,利用分子生物技术来提高养殖鱼类的抗病力势在必行。我们构建了大菱鲆脾脏和头肾cDNA文库,2个文库的库容分别达到2.26×106和1.45×106。通过测序共获得了3656条EST序列,经生物信息学分析,鉴定了149个新的大菱鲆基因,其中免疫抗病相关的基因45个,均首次在大菱鲆中被发现。
【作者】孟亮;
【导师】陈松林;
【作者基本信息】中国海洋大学,海洋生物学,2014,博士
【关键词】半滑舌鳎;精子发生;基因;大菱鲆;表达序列标签;免疫相关基因;

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