七甲川花菁类荧光小分子IR-780对肿瘤细胞的靶向特性及机制研究

【摘要】研究背景肿瘤作为严重威胁人类健康的重大疾病之一，历年来一直是人类医学研究中的重点和难点。尽管近年来关于肿瘤的生物学基础和临床治疗研究取得了显著的进展，但是由于仍然缺乏高特异性的早期诊断方法和有效的治疗措施，当前肿瘤病人的治疗及预后依旧不理想。分子影像学技术为肿瘤的早期诊断与疗效评价提供了重要手段，是目前国内外高度重视的热点前沿领域，其中光学成像技术通过制备肿瘤特异性的多功能荧光分子探针，实现对肿瘤细胞的靶向荧光成像。该方法具有操作简便、灵敏度高和无辐射暴露的优点，为建立光学成像引导的肿瘤诊断和治疗的新方法开辟了新途径，同时将极大地提高肿瘤早期诊断的灵敏度和特异性，具有重要的研究意义和应用前景。近红外荧光(nearinfraredfluorescence，NIRF)由于其波长范围在700-900nm，具有较强的组织穿透深度，同时组织自发荧光较弱，具有优越的在体荧光成像优势。近红外荧光成像已成为当前肿瘤在体成像和检测中最具潜力的技术之一，具有重要的应用前景。本课题组前期工作发现了同时具有肿瘤靶向作用和近红外荧光特性的七甲川花菁类小分子IR-780，提出了不需要通过化学连接来制备肿瘤靶向成像的多功能分子探针的策略。该荧光分子具有优越的荧光特性，位于近红外荧光波长范围，具有较强的组织穿透能力以及极大地降低生物组织自身荧光干扰的特点，同时在血清中稳定性好，可用于在生物体内的近红外荧光成像；进而发现该化学物为亲脂性阳离子化合物，不需要与肿瘤特异性分子连接，自身即可选择性地高效蓄积在肿瘤细胞中，在多种肿瘤动物模型中，均表现出独特的靶向识别和近红外荧光成像的特性；而且进入生物体后，可高效富集在肿瘤组织部位，可保持较长时间的荧光信号(超过20天)，而存在于循环血液中的化合物在短期内可被机体完全排出体外。肿瘤组织和周围正常对照组织荧光信号比值可达20，而通常的肿瘤部位与正常组织荧光信号比值达到3即可认为具有肿瘤主动靶向作用，显示其具有重要潜在应用前景。与目前研究的多功能分子探针相比，该分子不需进行任何化学连接反应，自身结构即具有对肿瘤细胞的高效靶向作用和良好的近红外荧光成像特性。虽然我们前期已经报道了该分子的诸多优点和肿瘤体内成像应用，但是对其进入肿瘤细胞的亚细胞定位和影响因素，以及进入肿瘤细胞后的处于何种状态尚未进行研究，本课题主要从IR-780在肿瘤细胞中的亚细胞定位和结合特点以及其选择性蓄积的影响机制进行研究。研究方法1.IR-780在肿瘤细胞中的亚细胞定位及其结合特点1.1IR-780在肿瘤细胞中亚细胞定位的体外研究通过应用亚细胞器特异性探针，包括线粒体探针Mito-trackerRed和罗丹明123(Rhodamine，Rh123)、溶酶体探针Lyso-trackerRed、高尔基体探针Golgi-trackerRed以及内质网探针ER-trackerRed与IR-780共同标记肿瘤细胞，以明确IR-780在肿瘤细胞中的亚细胞定位。进一步通过10μMRh123标记肿瘤细胞后与1、5、10及20μM浓度的IR-780共同孵育，以观察IR-780在不同孵育浓度下其线粒体定位有无改变。1.2IR-780在肿瘤细胞中亚细胞定位的体内研究为了观察IR-780在体内荷瘤模型中是否定位于肿瘤细胞线粒体，构建表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的rTDMC皮下荷瘤模型，通过尾静脉注射IR-780进行肿瘤成像，48h后分离肿瘤组织，消化后接种培养，待其贴壁后孵育Mito-trackerRed。通过激光共聚焦显微镜观察IR-780、GFP与Mito-trackerRed的共定位分布。1.3IR-780与肿瘤细胞线粒体的结合特点研究通过检测IR-780标记的肿瘤细胞线粒体在裂解前后吸收光谱的改变，明确IR-780是否与线粒体中的蛋白或DNA发生了结合。进一步提取IR-780标记的体内外肿瘤细胞的线粒体，通过SDS-PAGE电泳和NIR成像观察IR-780与线粒体蛋白的结合。2.IR-780靶向肿瘤细胞的影响因素研究2.1能量代谢对肿瘤细胞摄取IR-780的影响为了研究IR-780进入肿瘤细胞是否为能量依赖过程，首先观察冰浴处理后肿瘤细胞摄取IR-780的改变，进一步通过2-脱氧葡萄糖和寡霉素分别抑制肿瘤细胞的糖酵解和氧化磷酸化检测两种供能途径对其摄取的影响。2.2细胞膜转运体对肿瘤细胞摄取IR-780的影响为了检测肿瘤细胞膜表面的摄取和外排相关转运体是否参与了IR-780的摄取过程，分别应用有机阴离子转运多肽(organicanion-transportingpolypeptides，OATPs)和ATP结合盒转运蛋白(ATPbindingcassettetransporters,ABCs)各亚型的特异性抑制剂处理肿瘤细胞后，观察细胞摄取IR-780的变化特点。在此基础上进一步检测了肿瘤细胞和正常细胞OATP1B3在mRNA水平的表达差异。2.3膜电位和细胞内吞对肿瘤细胞摄取IR-780的影响为了观察细胞膜电位和线粒体膜电位是否参与了肿瘤细胞摄取IR-780的过程，采用高钾溶液、抗菌素肽和喹巴因使细胞膜电位去极化，使用FCCP使线粒体膜电位去极化后观察肿瘤细胞对IR-780的摄取。使用细胞内吞抑制剂处理肿瘤细胞后，观察IR-780是否通过细胞内吞进入肿瘤细胞。研究结果1.IR-780选择性蓄积于肿瘤细胞的线粒体中并与某些线粒体蛋白发生结合通过观察IR-780与细胞器标志物进行共定位比较研究，发现IR-780蓄积于肿瘤细胞的线粒体中，而且不同的孵育浓度对其亚细胞定位无影响。Mito-trackerRed与IR-780标记的表达绿色荧光蛋白的体内肿瘤细胞进行共定位研究进一步在体内模型中证明IR-780定位于肿瘤细胞的线粒体内。IR-780标记肿瘤细胞的线粒体裂解前后其与蛋白的吸收峰发生了改变，提示IR-780可能与线粒体中的蛋白发生了结合。进一步通过对肿瘤细胞线粒体蛋白的SDS-PAGE电泳和NIR成像明确IR-780与线粒体中的70kD和40kD蛋白发生了结合。2.肿瘤细胞的糖酵解、膜电位和OATP1B3影响了IR-780的选择性蓄积肿瘤细胞经过冰浴处理后，发现IR-780在线粒体内的蓄积得到了显著抑制，提示IR-780进入肿瘤细胞为能量依赖的过程。进一步发现肿瘤细胞摄取IR-780依赖于细胞糖酵解而非氧化磷酸化。此外，细胞内吞和ABC转运体未参与肿瘤细胞摄取IR-780的过程。但是，OATP转运体的抑制剂可以显著抑制肿瘤细胞对IR-780的摄取，提出肿瘤细胞高表达的OATP1B3对IR-780的摄取可能发挥关键作用。同时，肿瘤细胞膜电位参与IR-780的摄取而线粒体膜电位未参与此过程。结论本课题研究了七甲川花菁类荧光小分子IR-780在肿瘤细胞中的亚细胞定位和其在线粒体内的结合特点，同时对其进入肿瘤细胞的影响因素进行了探讨，取得的主要结论包括：1.IR-780选择性在体内外肿瘤模型中均蓄积于肿瘤细胞的线粒体中，且不同孵育浓度对其亚细胞定位无影响，进入线粒体后该探针可能与其中的70kD和40kD蛋白发生结合；2.IR-780进入肿瘤细胞为主动运输过程，主要由糖酵解、细胞膜电位和OATP1B3介导其摄取，而氧化磷酸化、细胞内吞、ABC转运体和线粒体膜电位未参与此过程。
【作者】张二龙；
【导师】史春梦；
【作者基本信息】第三军医大学，军事预防医学，2014，博士
【关键词】IR-780；线粒体；结合特点；糖酵解；细胞膜电位；OATP1B3；

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