高效石油烷烃降解菌及原油降解基因工程菌构建研究

【摘要】随着石油的大量开采及使用量的不断增加,大量石油污染物进入环境并造成了严重污染,同时也给人类及其它生物带来极大的危害。微生物修复是迄今为止处理石油污染问题相对安全有效的一种方法,其主要原理是通过从自然环境中筛选驯化可降解石油污染物的各类菌株,并在污染区域原位作用以降解污染物。用于降解石油污染物的微生物菌剂往往为多菌种混合发酵制备,在处理过程中可能存在竞争抑制致使菌群中各菌种数量比例发生不同程度的改变,导致使用效果不理想。为了提高对石油污染物的降解效率,减少和避免复合菌种使用时各菌种之间的竞争问题,利用基因工程方法构建可降解石油污染物的基因工程菌成为一种较为有效地手段。工程菌具有可降解多种有害物质、效率高、适应性强等特点,是环境污染无害化处理的理想菌株。本研究自长庆、胜利及克拉玛依油田采集到的石油污染土壤中分离得到10株可降解石油烃的菌种,从中筛选出一株降解效果最好的菌株将其命名为BS3,通过形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验以及分子生物学测序等方法对该菌株进行分析鉴定以确定菌株的系统发育地位,并对其生长特性和降解石油烃的效果进行研究,研究发现该菌缺乏对芳香烃物质的降解能力。为加强该菌的降解性能,对实验室保存的高效芳香烃降解菌株BNF1进行了芳香烃降解效果的确证、降解基因的定位、克隆及在大肠杆菌中的表达研究,进一步以pUT/mini-Tn5自杀性质粒载体作为基因工程菌构建的重组表达载体,通过三亲结合技术将菌株BNF1质粒中的降解基因导入菌株BS3的染色体中,成功构建基因工程菌,并对工程菌株的生长特性、降解特性以及稳定性进行了研究。此后,以高效原油降解基因工程菌为基础制备微生物菌剂,进行石油污染土壤生物修复室内模拟实验。研究比较了五种不同处理方法对石油污染土壤生物修复的效果,结合玉米种子的发芽状况作为评价修复效果的重要指标。在室内模拟实验的基础上选取长庆油田第五采油厂的一个废弃泥浆池进行井场初步原位修复实验,为大范围治理石油污染土壤提供了技术方法和应用的可行性。主要研究结果如下：1)从石油污染土壤中分离得到10株可降解石油烃的菌种并测定这10株菌对石油烃的降解率,筛选出一株降解效果较好的菌株将其命名为BS3。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验以及16SrRNA基因序列同源性分析等方法,鉴定BS3菌株为不动杆菌(Acinetobactersp.)。2)对石油烃降解细菌Acinetobactersp.BS3的生长特性、影响该菌降解效率的环境因素和该菌对石油烃中具体组分的降解效果进行了详细研究。研究发现菌株BS3生长和降解石油烃的最佳初始石油烃浓度为600mg/L；最适pH为7.0：最适温度为28℃；最佳接种量为1%；最适摇床转数为120-200r/min。菌株BS3对原油中的烷烃组分具有高效的降解性,对总烷烃的降解率达到了81%。而对芳香烃组分的降解效果不佳,降解率只有21%。3)对本实验室保存的芳香烃降解菌株BNF1(Pseudomonasputida)进行降解性能验证并检测双加氧酶酶活。通过酶学研究、质粒消除、PCR扩增等方法对芳香烃降解菌PseudomonasputidaBNF1中的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(C230)进行定位,发现该基因位于质粒上。通过PCR扩增并测序,C230基因全长924bp,编码307个氨基酸,并包含起始密码子和终止密码子。通过表达载体pET-30a(+)对C230基因在大肠杆菌E.coliBL21中进行了表达,电泳和双加氧酶酶活检测结果均表明该双加氧酶作为胞内酶主要存在于菌株细胞内部,在胞外的含量极少。4)将C230基因重组到自杀性质粒pUT/mini-Tn5转座子载体中,构建转基因载体pUT/mini-Tn5-C25O。利用三亲结合转移技术将C230基因插入到受体菌BS3的染色体中,并筛选到一株转基因工程菌Acinetobactersp.BS3-C23O。通过对基因工程菌BS3-C23O的生长特性、底物降解特异性、酶活性以及稳定性等因素进行研究,结果表明重组菌株BS3-C23O显示出广泛的底物降解特异性,较高的酶活性和良好的稳定性,该工程菌对原油中的烷烃和芳香烃组分同时具有较好的降解效果,且生长特性并没有明显变化。这些特性对于处理环境中原油的污染是十分必要的。5)以高效原油降解基因工程菌为基础,制备固定化菌剂进行石油污染土壤生物修复室内模拟实验研究。实验结果表明,石油污染土壤经过60天的修复实验后,土壤中的石油烃含量大幅度降低,使用微生物固定化菌剂配合每日翻土提高土壤中的氧含量大大增强了石油污染土壤的修复效果。土壤中的石油烃被大量降解,土壤毒性逐渐降低,土壤的土质被缓慢改良逐渐适于植物的生长。在室内模拟实验的基础上选取长庆油田第五采油厂的一个废弃泥浆池进行井场初步原位修复实验,废弃物泥浆经固体菌剂原位处理后水分含量降至50-60%以下,pH值降至7.8,可溶性总盐降低50%左右,石油烃类物质降解率达到了80%以上,有机质含量大大增加,取得了一定的修复效果。
【作者】谢云；
【导师】陈五岭；
【作者基本信息】西北大学，微生物学，2014，博士
【关键词】石油烃；生物降解；邻苯二酚2；3-双加氧酶；三亲结合；基因工程菌；

【参考文献】
[1]汤琼.抛物问题时间连续全离散有限元的超收敛性[D].湖南师范大学,计算数学,2004,硕士.
[2]武晓媛.论当今国服设计的价值理想[D].上海戏剧学院,艺术学,2013,硕士.
[3]刘君昂.茂兰自然保护区三岔河生态旅游开发的研究[D].中南林学院,森林经理学,2004,硕士.
[4]王坚.大学生创业成功关键因素研究[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[5]周政,刘进忙.基于强跟踪滤波器的MACA-MIE模型及跟踪算法[J].控制与决策,2013,01:100-104.
[6]杨海涛,吴国旸,陈西颖,贺庆,宋新立.用于间歇性电源高渗透电网规划的安全性评估方法[J].电力系统自动化,2012,24:15-20.
[7]陈元晓.基于评价理论对金砖国家第四次峰会报道的态度资源对比研究[D].郑州大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[8]潘广源,柴伟,乔俊飞.DBN网络的深度确定方法[J].控制与决策,2015,02:256-260.
[9]朱玉全,孙志挥,张仲楠.约束关联规则的有效挖掘算法[J].计算机工程,2002,02:29-31.
[10]余翔,李伟.改革红利形势下企业创新自觉的整合问题研究[J].未来与发展,2014,02:49-53+21.
[11]唐鹤隽.多元回归和神经网络在武汉市房地产预测中的应用比较[D].华中科技大学,应用统计,2013,硕士.
[12]张梁.关于我国多元化纠纷解决机制下的诉讼与调解衔接问题的探讨[D].青岛大学,诉讼法学,2013,硕士.
[13]王伟.双[-6-氧-（3-脱氧柠檬酸单酯-4）]-β-环糊精HPLC手性流动相添加剂法拆分头孢类抗生素[D].中南民族大学,分析化学,2013,硕士.
[14]王珏.电子细胞中的混沌与自组织[D].吉林大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[15]胡飞,段玲,丁建文.锯齿型石墨纳米带叠层复合结的电子输运[J].物理学报,2012,07:416-421.
[16]冯耀.六流T型连铸中间包内流体流动行为的数学物理模拟[D].东北大学,钢铁冶金,2010,硕士.
[17]吴学龙.基于行为建模的人工鱼动画技术研究[D].浙江大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[18]张志.感应装定数据传输技术研究[D].中北大学,机械电子工程,2014,硕士.
[19]赵占娟.新型光敏抗菌药物的研究[D].北京协和医学院,药物化学,2014,博士.
[20]尹方.低多层钢框架墙板组合结构有限元分析[D].武汉理工大学,结构工程,2013,硕士.
[21]王亚妮.广义测不准原理下费米系统的热力学性质研究[D].宁夏大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[22]刘婷婷.苦参碱逆转急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药的机制研究[D].浙江中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2014,硕士.
[23]丛林.山区高填方路堤沉降规律及稳定性分析[D].湖北工业大学,结构工程,2013,硕士.
[24]宫俊,汪定伟.敏捷化产品开发中调度问题的研究[J].控制与决策,2002,S1:707-710.
[25]邓立博.MANET入侵检测系统研究与实现[D].哈尔滨工程大学,计算机技术（专业学位）,2012,硕士.
[26]吴以凡,艾丽君,欧阳树生,吴铁军.面向钢铁生产过程质量控制的动态数据挖掘方法[J].冶金自动化,2006,04:6-10.
[27]冯媛媛.跨国公司在华并购行为分析[D].对外经济贸易大学,国际贸易,2004,硕士.
[28]潘春艳.汉语特殊比较标记“尤其（是）”的功能研究[D].华东师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[29]姚明壮.求解孤子方程的朗斯基技巧和法夫式技巧[D].大连理工大学,应用数学,2013,硕士.
[30]王婧.高新技术行业上市公司无形资产与成长性研究[D].安徽大学,会计学,2014,硕士.
[31]芦丽君.产学研合作教育人才培养模式的探索[D].湖南师范大学,教育,2004,硕士.
[32]刘强.基于商业银行的内部审计增值评价研究[J].商,2014,26:135.
[33]吕琳君.智能优化算法在集成电路设计中的应用研究[D].南京邮电大学,电路与系统,2013,硕士.
[34]胡凡,万丽,张修华,董兵海,许祖勋,王世敏.可溶性聚苯胺/聚乙烯醇掺杂氧化石墨烯复合材料的制备[J].材料导报,2012,10:77-81.
[35]满海军.外资企业投资选址影响因素研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[36]陈斌.基于顾客满意的高档商务饭店服务环境研究[D].浙江大学,2006.
[37]李鸿辉.CdS、Au纳米粒子自组装薄膜研究[D].武汉理工大学,材料学,2004,硕士.
[38]金石.掩护结合传切配合的临场表现分析与绩效研究[D].沈阳体育学院,体育教育训练学,2014,硕士.
[39]李卫东.图像处理技术在梅钢连铸板坯测长系统中的应用[J].冶金自动化,2010,06:51-54+68.
[40]刘英晓.元认知干预技术中情感组织者对考试焦虑治疗效果的影响[D].辽宁师范大学,应用心理学,2011,硕士.
[41]李少文,吴一龙,汪建平.立体化电子病历与循证医学研究[J].循证医学,2003,02:74-77.
[42]唐宇姣.从肺病模型大鼠病理改变及相关活性物质SP、VIP、INOS含量变化探讨“肺病及肠”病理传变机制[D].成都中医药大学,中医临床基础,2012,硕士.
[43]胡芳捷.电子商务环境下铁路货运业务流程再造研究[D].西南交通大学,物流工程,2014,硕士.
[44]童菁.英汉礼貌用语对比研究[D].华中师范大学,应用语言学,2003,硕士.
[45]裴士轻.热塑性塑料流变性新型测定方法研究[D].上海工程技术大学,材料加工工程,2014,硕士.
[46]刘鑫.阳离子双子表面活性剂的合成及性能研究[D].东北石油大学,油气井工程,2013,硕士.
[47]李伟.光声成像中超声信号采集及预处理技术研究[D].复旦大学,电路与系统,2012,硕士.
[48]李妍妍.IQ不平衡OFDM系统的信道估计与补偿算法研究[D].南京理工大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[49]蒋金洋.城乡结合部社区增量民主发展研究[D].西南交通大学,中外政治制度,2013,硕士.
[50]侯玉杰.AHP和DEA混合算法在OA系统中的应用研究[D].中国地质大学（北京）,计算机技术,2014,硕士.