LPS经鼻小鼠帕金森病模型的建立及Rho激酶靶点干预探讨

【摘要】第一部分LPS经鼻小鼠PD模型的建立目的：以MPTP经鼻为阳性对照,生理盐水为阴性对照,研究LPS经鼻小鼠行为学、病理学和神经生物化学等PD特征性的改变。方法：10月龄雌性C57BL/6小鼠,随机分为生理盐水对照组、LPS组和MPTP组,采用LPS10μg/只、MPTP400μg/只隔天右侧经鼻滴注5个月,期间第1、3、5个月分别使用旷场实验观察小鼠的运动功能,5个月时胶布移除实验观察小鼠左右侧肢体运动功能的对称性。5个月后,取脑进行免疫荧光染色、同时提取组织蛋白,采用Westernblot法检测黑质内TH(酪氨酸羟化酶)、α-synuclein(α-突触核蛋白)以及脑组织内CHAT(乙酰胆碱转移酶)的表达。HPLC检测小鼠纹状体内多巴胺(DA)以及其代谢产物DOPAC、高相草酸(HVA)、DA/HVA以及其他递质包括去甲肾上腺素(NE)、异丙肾上腺素(Iso)、5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的变化。结果：LPS单侧经鼻可引起小鼠运动不对称及运动功能减退,MPTP单侧经鼻并未引起小鼠运动障碍；LPS或MPTP经鼻均可引起小鼠黑质多巴胺能神经元丢失及a-synuclein的沉积；LPS或MPTP经鼻可引起小鼠纹状体内TH表达减少及DA等神经递质释放减少。结论：LPS经鼻可以制备小鼠PD模型,呈现PD模型的典型特征。第二部分LPS经鼻小鼠PD模型的机制探讨目的：体内和体外实验探讨LPS致小鼠PD的机制。方法：LPS经鼻制备的PD小鼠体外培养脾脏单核细胞(T细胞),加入外源性α-synuclein(lμg/mL),48小时后观察系统免疫炎症反应。取PD小鼠脑组织进行黑质区小胶质细胞和磷酸化NF-κB的免疫荧光染色,同时提取组织蛋白,采用Westernblot法检测小鼠脑内NF-κB的表达,ELISA法检测黑质内炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。Westernblot法检测小鼠脑内M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞标志物iNOS与Arginase-1(Arg-1)的表达。体外使用LPS(1μg/mL)刺激小胶质细胞瘤细胞系BV-2细胞,48小时后收集上清液孵育PC12多巴胺能神经元,检测BV-2细胞内iNOS.核转录因子NF-kB和AP-1的表达及Rho激酶底物MYPT和MLC,上清液(条件培养液)IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等炎症因子和炎症介质的释放,PC12神经元细胞活力及LDH释放。结果：LPS经鼻制备的PD小鼠体外培养脾脏细胞的免疫炎症反应包括抗原特异性T细胞,NO和炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Thl,Th2Th17因子与对照组相比均没有差别。小鼠脑内NF-κB明显激活,黑质区小胶质细胞密度增加,磷酸化NF-κB表达增加,释放的炎症因子IL-β>TNF-α也明显增加。此外,还发现LPS经鼻小鼠脑内M2型小胶质细胞标志物Arg-1的表达明显下降,M1型小胶质细胞标志物iNOS与Arg-1的比值明显升高。体外实验表明LPS可以激活小胶质细胞瘤细胞系BV-2细胞,促进其细胞内iNOS的表达升高,核转录因子NF-kB和AP-1的表达增加,其上清液(条件培养液)中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等炎症因子和炎症介质的释放明显增加；LPS可磷酸化BV-2细胞内的Rho激酶底物MYPT和MLC;LPS刺激BV-2细胞的条件培养液可引起PC12神经元细胞活力下降和LDH释放增加。结论：LPS经鼻未能引起小鼠系统免疫炎症反应,仅诱导脑内的小胶质细胞向M1型转化,诱发脑内的炎症反应。LPS体外可激活BV-2细胞引起炎性反应,激活Rho激酶,其条件培养液可引起PC12神经元细胞活力下降和死亡。第三部分Rho激酶抑制剂法舒地尔对LPS经鼻小鼠PD模型的保护作用及机制探讨目的：了解Rho激酶抑制剂法舒地尔(Fasudil)在LPS经鼻制备的PD小鼠中的治疗潜能及可能机制。方法：8-10周龄雌性C57BL/6小鼠,随机分为生理盐水对照组、LPS组、法舒地尔组,采用LPS10μg/只隔天右侧经鼻滴注1个月,同时法舒地尔组给予(40mg/kg)腹腔注射,1个月时使用旷场实验观察小鼠的运动功能,胶布移除实验观察小鼠左右侧肢体运动功能的对称性。1个月后取脑Westernblot法检测Rho激酶底物MYPT和MLC的变化。免疫荧光染色、Westernblot法检测黑质和嗅球内TH、α-synuclein以及纹状体内TH的表达。Westernblot法进一步检测PD小鼠脑组织内NF-κB的表达及M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞标志物iNOS、Arginase-1(Arg-1)的表达以及两者比值的变化。结果：LPS经鼻可磷酸化脑内的Rho激酶底物MYPT和MLC,而法舒地尔可明显抑制磷酸化MYPT和MLC的表达。法舒地尔干预可改善LPS经鼻引起的小鼠运动功能减退和运动不对称、小鼠黑质和嗅球多巴胺能神经元丢失、a-synuclein沉积、脑内炎症反应并诱导小胶质细胞向M2型转化等改变。结论：法舒地尔可有效抑制LPS经鼻激活的脑内Rho激酶,通过诱导脑内M1型小胶质细胞向M2型转化,抑制脑内的炎症反应缓解LPS经鼻引起的小鼠PD行为学和病理学的改变。结论1.LPS经鼻可致小鼠运动减少、黑质多巴胺能神经元的丢失、α-synuclein的沉积、纹状体内TH表达减少及神经递质的释放减少等行为学、病理学和神经生物化学的改变,从而成功建立小鼠PD模型。2.LPS致小鼠PD的机制可能是通过诱导脑内的小胶质细胞向M1型转化,诱发脑内的炎症反应以及激活Rho激酶实现。3.法舒地尔干预可有效抑制LPS经鼻激活的脑内Rho激酶。4.法舒地尔干预可诱导脑内M1型小胶质细胞向M2型转化,抑制脑内的炎症反应缓解LPS经鼻引起的小鼠PD行为学和病理学的改变。
【作者】和青；
【导师】肖保国；
【作者基本信息】复旦大学，神经病学，2013，博士
【关键词】LPS；小鼠PD模型；炎症反应；Rho激酶；法舒地尔；

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