黄芪甲苷对高糖所致人肾小球系膜细胞损伤的保护作用及其调控NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信号通路的机制研究

【摘要】糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(DiabetesMellitus,DM)最常见的慢性微血管并发症之一,其发病率随着糖尿病病程的延长而升高。部分DN患者会进展为终末期肾病(End-stagerenaldisease,ESRD),引起肾功能衰竭和肾移植,甚至导致患者死亡。目前DN发病机制尚未被完全阐明,但其发病初期显著的病理特征是肾小球系膜细胞(mesangialcells,MCs)增生所致的肾小球肥大和MCs收缩功能障碍引起的肾小球滤过率(glomerularfiltrationrate,GFR)的升高。高糖状态下机体氧化应激反应增强,活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)生成增多。NADPH氧化酶(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPHoxidase)是MCs中ROS的主要来源,Nox4是MCs中最重要的NADPH氧化酶亚基。NADPH氧化酶Nox4源性ROS参与了高糖诱导的MCs异常增殖。Akt/NF-κB信号通路在高糖所致的MCs损伤中也发挥着至关重要的作用,且与NADPH氧化酶介导的ROS生成密切相关。上述通路还参与了瞬时受体电位阳离子通道6(CanonicalTransientReceptorPotential6,TRPC6)的调节,高糖环境下TRPC6蛋白表达下调介导的钙离子内流减少是MCs收缩功能受损的主要原因。虽然对于DN的防治研究已不断深入,但寻找安全有效的治疗方法和药物仍是当务之急。黄芪为临床常用中药,具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗缺血性脑损伤等多种药理活性。黄芪甲苷(AstragalosidesⅣ,AS-Ⅳ)是从黄芪中提取的主要皂苷类活性成分。本课题组前期研究发现AS-Ⅳ能有效减轻糖尿病大鼠的白蛋白尿,并能有效抑制其氧化应激损伤。黄芪甲苷对于体外培养的系膜细胞的影响目前尚不十分明确。本研究旨在考察高糖诱导系膜细胞损伤的具体机制及其黄芪甲苷的干预作用,以期为临床治疗糖尿病肾病提供有效的候选药物和一定的实验依据。目的：考察高糖对人肾小球系膜细胞增殖情况和TRPC6蛋白表达水平及钙离子内流的影响,并探讨其对NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信号通路的调节作用,考察黄芪甲苷对高糖所致人肾小球系膜细胞损伤的保护作用及其干预机制,为糖尿病肾病的理论研究和临床治疗提供新的思路。方法：1.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下3组：(1)正常对照(NG:5.6mM葡萄糖)组、(2)渗透压对照(MA:NG+24.5mM甘露醇)组、(3)高糖(HG：25mM葡萄糖)组,采用MTT检测各组细胞在孵育24h、48h、72h、96h后的增殖情况。2.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG6h组,(3)HG12h组,(4)HG24h组,(5)HG36h组,(6)HG48h组。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Nox4mRNA和TRPC6mRNA的表达水平,采用Westernblot法检测各组细胞的Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表达水平。3.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下7组：(1)NG组,(2)HG0.5h组,(3)HG1h组,(4)HG3h组,(5)HG12h组,(6)HG24h组,(7)HG48h组。采用Westernblot法检测各组细胞的IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。4.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)NG+Tempol100μM组,(3)NG+DPI10μM组,(4)HG组,(5)HG+Tempol100μM组,(6)HG+DPI10μM组,给药48h后,采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性。5.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)NG+FAMsiRNA组,(3)NG+Nox4siRNA组,(4)HG组,(5)HG+FAMsiRNA组,(6)HG+Nox4siRNA组。刺激48h后,采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用Westernblot法检测各组细胞Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表达水平。6.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)NG+FAMsiRNA组,(3)NG+IκBαsiRNA组,(4)HG组,(5)HG+FAMsiRNA组,(6)HG+IκBαsiRNA组。刺激48h后,采用MTT法检测各组细胞增殖活力,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Nox4mRNA和TRPC6mRNA的表达水平,采用Westernblot法检测各组细胞Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表达水平以及Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。7.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG组,(3)HG+LY29400210μM组,(4)HG+DPI10μM组,(5)HG+Tempol100μM组,(6)HG+Sul500μM组,给药48h后,采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞的Nox4mRNA和TRPC6mRNA的表达水平,采用Westernblot法检测各组细胞的Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表达水平以及Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。采用Fluo-3/AM荧光探针法检测各组细胞的游离钙离子浓度。8.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下9组：(1)NG组,(2)MA组,(3)HG组,(4)HG+AS-Ⅳ5μM组,(5)HG+AS-Ⅳ10μM组,(6)HG+AS-Ⅳ25μM组,(7)HG+AS-Ⅳ50μM组,(8)HG+AS-Ⅳ100μM组,(9)HG+0.5%DMSO组。给药48h后,采用MTT法检测各组细胞的增殖情况。9.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下9组：(1)NG组,(2)MA组,(3)HG组,(4)HG+AS-Ⅳ5μM组,(5)HG+AS-Ⅳ10μM组,(6)HG+AS-Ⅳ25μM组,(7)HG+AS-Ⅳ50μM组,(8)HG+AS-Ⅳ100μM组,(9)HG+0.5%DMSO组。给药48h后,通过计算细胞总蛋白/细胞数的比值考察各组细胞的肥大情况。10.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下7组：(1)NG组,(2)NG+AS-Ⅳ5μM组,(3)NG+AS-Ⅳ10μM组,(4)NG+AS-Ⅳ25μM组,(5)NG+AS-Ⅳ50μM组,(6)NG+AS-Ⅳ100μM组,(7)NG+0.5%DMSO组。给药48h后,采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,考察黄芪甲苷药物本身有无细胞毒性。11.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG组,(3)HG+AS-Ⅳ25μM组,(4)HG+AS-Ⅳ50μM组,(5)HG+AS-Ⅳ100μM组,(6)HG+Tempol100μM组,给药48h后,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平。12.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG组,(3)HG+A-Ⅳ25μM组,(4)HG+AS-Ⅳ50μM组,(5)HG+AS-Ⅳ100μM组,(6)HG+OAG100μM组,给药48h后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞的TRPC6mRNA的表达水平,采用Westernblot法检测各组细胞的TRPC6蛋白的表达水平,采用Fluo-3/AM荧光探针法检测各组细胞的游离钙离子浓度。13.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG组,(3)HG+AS-Ⅳ25μM组,(4)HG+AS-Ⅳ50μM组,(5)HG+AS-Ⅳ100μM组,(6)HG+DPI100μM组,给药48h后,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞的Nox4mRNA的表达水平,采用Westernblot法检测各组细胞的Nox4蛋白的表达水平。14.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG组,(3)HG+AS-Ⅳ25μM组,(4)HG+AS-Ⅳ50μM组,(5)HG+AS-Ⅳ100μM组,(6)HG+LY2940010μM组,给药48h后,采用Westernblot法检测各组细胞Akt蛋白的磷酸化水平。15.将常规培养的人肾小球系膜细胞分为以下6组：(1)NG组,(2)HG组,(3)HG+AS-Ⅳ25μM组,(4)HG+AS-Ⅳ50μM组,(5)HG+AS-Ⅳ10μM组,(6)HG+Sul500μM组,给药48h后,采用Westernblot法检测各组细胞的IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。结果：1.高糖培养一定时间后人肾小球系膜细胞的增殖活力显著升高,细胞明显肥大。但给予甘露醇的系膜细胞活力没有明显变化,表明高糖的上述作用并非由于其高渗透压所致。高糖还能明显增强人肾小球系膜细胞中NADPH氧化酶的活性,促进ROS的生成。高糖对系膜细胞增殖的促进作用能够被NADPH氧化酶抑制剂和ROS抑制剂有效抑制。2.高糖培养一定时间后人肾小球系膜细胞中NADPH氧化酶亚基Nox4mRNA及蛋白表达水平显著上调。采用RNAi技术特异性沉默Nox4基因后,高糖环境下人肾小球系膜细胞内NADPH氧化酶的活性和ROS的生成均显著降低,且细胞增殖也受明显抑制,提示高糖促系膜细胞增殖作用可能是通过上调Nox4亚基的表达,从而促进NADPH氧化酶活化和ROS生成来实现的。3.高糖培养一定时间后人肾小球系膜细胞中Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平显著上调,激活Akt/NF-κB信号通路。NADPH氧化酶抑制剂和ROS抑制剂均能显著抑制高糖环境下人肾小球系膜细胞中Akt和NF-κB的活化,提示高糖对人肾小球系膜细胞中Akt/NF-κB信号通路的调控作用与NADPH氧化酶性ROS具有紧密的相关性。Akt抑制剂能显著抑制高糖环境下人肾小球系膜细胞中Nox4蛋白的表达水平并抑制NADPH氧化酶性ROS的生成,还能有效抑制IκBα蛋白的磷酸化和降解,以及细胞增殖水平,而IκBα表达被抑制时对高糖环境下MCs中Akt蛋白的磷酸化水平、Nox4蛋白表达水平、NADPH氧化酶活性以及ROS水平均没有明显影响,仅抑制细胞异常增殖。提示在上述信号通路中Akt活化与NADPH氧化酶性ROS生成可能是相互平行或相互交叉影响,并共同参与促进NF-κB的活化。4.高糖培养一定时间后人肾小球系膜细胞中TRPC6mRNA和蛋白表达水平显著下调,钙离子内流显著减少。当Nox4或IκBα表达被抑制时,高糖下调的TRPC6蛋白表达水平显著升高；此外当采用NADPH氧化酶抑制剂、ROS抑制剂、Akt抑制剂以及IκBα抑制剂时均能显著增强高糖环境下人肾小球系膜细胞中TRPC6蛋白的表达,并促进钙离子内流,提示高糖可能是通过激活NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信号通路来发挥对人肾小球系膜细胞中TRPC6蛋白表达和钙离子内流的抑制作用,从而导致系膜细胞收缩功能障碍。5.黄芪甲苷能浓度依赖性地抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞异常增殖和细胞肥大,以及TRPC6蛋白表达下调和钙离子内流减少。6.黄芪甲苷能浓度依赖性地抑制高糖环境下人肾小球系膜细胞中的ROS生成、NADPH氧化酶活化、Nox4亚基的表达、Akt蛋白磷酸化以及IKBa蛋白磷酸化和降解,从而发挥对系膜细胞中高糖活化的NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信号通路的抑制作用。结论：1.高糖能诱导人肾小球系膜细胞的异常增殖和肥大,并显著抑制系膜细胞TRPC6蛋白的表达和钙离子内流,从而损伤系膜细胞活力和收缩功能。高糖诱导系膜细胞损伤的作用可能是通过调节NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-KB信号通路来实现的,在该信号通路中,NADPH氧化酶性ROS生成与Akt信号活化可能是相互平行或相互交叉作用,并共同存在于NF-κB信号的上游。2.黄芪甲苷对高糖诱导的人肾小球系膜细胞异常增殖和肥大以及TRPC6蛋白下调和钙离子内流减少具有有效的抑制作用,从而保护高糖环境下系膜细胞的活力和收缩功能。黄芪甲苷可能是通过抑制NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信号通路来发挥其保护作用。黄芪甲苷可成为临床上糖尿病肾病的有效候选治疗药物。
【作者】孙立；
【导师】李卫平；
【作者基本信息】安徽医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】糖尿病肾病；系膜细胞；NADPH氧化酶；活性氧；黄芪甲苷；

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