慢性免疫性血小板减少性紫癜中IL-27的表达与作用及大剂量地塞米松治疗对IL-12家族细胞因子的影响

【摘要】研究背景：原发性免疫性血小板减少性紫癜(primaryimmunethrombocytopenia,ITP)是一组免疫介导的血小板过度破坏所致的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30%。该病的临床特点是以皮肤黏膜及内脏出血、外周血血小板减少、骨髓巨核细胞发育成熟障碍为主要表现。自身抗体介导的血小板破坏增加是ITP的主要发病原因,即血小板膜表面糖蛋白(glycoprotein,GP)Ⅱb/Ⅲ和GPIb/IX复合物作为自身抗原,刺激机体免疫系统产生自身抗体,这些特异性的自身抗体通过Fab段与血小板膜表面自身抗原结合。这些结合自身抗体的血小板最终被机体的单核巨噬细胞系统所清除,从而导致外周血血小板减少。但是ITP发病具有明显的异质性。通过抗体检测发现：只能在50-70%的ITP患者体内检测到血小板自身抗体,且阴性结果不能排除诊断。ITP发病情况不能仅仅用体液免疫异常来解释。因此,近年来ITP发病机制的研究已经扩展到细胞免疫方面。研究认为,ITP发病呈辅助性T细胞(helperTcell,Th)1优势反应,Thl优势反应除可激活B细胞产生血小板自身抗体外,还能促进淋巴细胞的细胞毒作用。研究还发现细胞免疫异常在ITP发病及病情加重过程中起重要作用,其中Thl/Th2细胞亚群之间的平衡失调、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)和Th17细胞数量增加、调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)细胞的数量减少和功能异常是ITP细胞免疫应答异常的关键因素。白细胞介素(Interleukin,IL)-27是新近发现的1L-12家族成员之一,在调节T细胞分化方面发挥了重要作用。早期的研究证实,IL-27通过激活STAT-1和STAT-3信号通路,诱导Thl细胞发育过程中T细胞特异性转录因子(T-boxexpressedinTcells,T-bet)表达,伴随产生大量的干扰素-y(Interferon-gamma,IFN-y),并抑制IL-4,IL-5和IL-13等Th2型细胞因子的产生。但随后的研究表明IL-27可以通过诱导STAT1和SOCS1信号通路下调Th17细胞的转录因子孤核受体(Orphannuclearreceptor,RORyt)来抑制IL-17的表达。因此,IL-27作为一种多效性免疫调节因子在免疫应答过程中起双重调控作用。ITP是一种Thl和Th17细胞占优势的自身免疫性疾病。但目前有关IL-27在ITP发病机制中的作用还不清楚,且研究结论存在争议。我们推测IL-27可能通过调节ITP患者Th细胞的分化从而参与ITP的发病。本课题将结合[L-27血浆水平和信使核糖核酸(messengerRNA,mRNA)表达,分析ITP患者的IL-27与Th细胞亚群及其分泌的细胞因子、实验室指标之间的关系,以探讨IL-27在ITP发病机制中的作用,为ITP的病因研究和临床治疗提供科学依据。目的：研究在慢性ITP患者中IL-27的表达情况,并探讨其在慢性ITP发病机制中的作用。方法：1、慢性ITP患者31例,对照组来自于36例健康志愿者。2、流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测Thl,Th2和Th17细胞百分比。3、FlowCytomix技术检测血浆中IL-27,IFN-γ,IL-4和IL-17A的水平。4、实时荧光定量PCR法检测IL-27,T-bet,GATA结合蛋白(GATAbingingprotein,GATA)3和RORγtmRNA表达。5、提取慢性1TP患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)加入外源性重组人IL-27培养2天,检测培养后的PBMCs中Thl,Th2和Th17细胞占CD3+T细胞的比例。结果：1、慢性ITP患者血浆中IL-27,IFN-γ,IL-4和IL-17A细胞因子的水平：与正常对照组相比,IL-27,IFN-γ和IL-17A在慢性ITP患者外周血中显著升高(IL-27:60.42±43.68vs32.91±20.37pg/ml,P=0.001；IFN-γ:40.12±19.14vs23.21±10.87pg/ml,P<0.001；IL-17A:29.6±28.08vs9.21±7.9pg/ml,P<0.001).而IL-4在慢性ITP患者外周血中显著降低(IL-4:57.69±17.71vs78.7±29.82pg/ml,P=0.001).2、慢性ITP患者外周血中Thl,Th2和Th17细胞亚群的百分比：与正常对照组相比,Thl和Th17细胞比例在慢性ITP患者外周血中显著升高(Th1:19.38±9.18%vs13.19±5.33%,P=0.004:Th17:2.39±1.32%vs1.07±0.51%,P<0.001)。而Th2细胞在慢性ITP患者外周血中显著降低(Th2：1.15±0.52%vs1.9±0.64%,P<0.001).3、IL-27细胞因子和Thl,Th2,Th17细胞亚群及外周血血小板计数的相关性：在慢性ITP患者外周血中,IL-27细胞因子和Thl细胞亚群呈正相关(r=0.733,P<0.001),而与Th2,Th17,外周血血小板计数无相关性(Th2:r=-0.166,P=0.371；Th17:r=0.229,P=0.215；血小板计数：r=0.194,P=0.296).4、IL-27,T-bet,GATA-3和RORytmRNA在慢性ITP患者外周血中的表达：IL-27,,T-bet和RORγtmRNA在慢性ITP患者中的相对定量表达比正常对照组明显升高(IL-27:cITP3.46foldvscontrol,P<0.05；T-bet:cITP7.37foldvscontrol,P<0.05；RORγt:cITP11.1foldvscontrol,P<0.05)。GATA-3mRNA在慢性ITP患者中的表达与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05)。5、外源性重组人IL-27对慢性ITP患者PBMCs中Thl,Th2和Th17细胞的百分比的影响：外源性重组人IL-27能上调Thl细胞百分比(慢性ITP患者：19.63±5.88%vs31.7±10.71%,P=0.007；正常对照：9.93±2.66%vs18.46±4.84%,P=0.002),下调Th2细胞百分比(慢性ITP患者：1.15±0.21%vs0.96±0.18%,P=0.031；正常对照：2.15±0.49%vs1.68±0.40%,P=0.035)；外源性重组人IL-27能下调正常对照的Th17细胞百分比(1.38±0.45%vs0.81±0.35%,P=0.016),但对慢性ITP患者Th17细胞无影响(2.41±0.57%vs2.33±0.4%,P=0.62)。结论：1、慢性ITP患者PBMCs中的IL-27mRNA表达水平和血浆中IL-27浓度明显升高,提示IL-27可能参与了慢性ITP的发病过程。2、慢性ITP患者PBMCs中的T-bet和RORγtmRNA表达水平和血浆中IFN-γ和IL-17A浓度明显升高,同时慢性ITP患者外周血1Thl和Th17细胞百分比上升,表明慢性ITP是Thl和Th17细胞占优势的疾病,细胞免疫异常是慢性ITP的重要发病机制之一。3、慢性ITP患者血浆IL-27浓度和外周血Thl百分比成正比,外源性重组人IL-27上调Thl细胞百分比,表明IL-27是通过促进Thl细胞分化参与慢性ITP的发病机制。研究背景：原发性免疫性血小板减少性紫癜(primaryimmunethrombocytopenia,ICP)是一种自身免疫性出血性疾病,该病的临床特点是患者体内抗血小板自身抗体增多,导致结合了自身抗体的血小板被机体的单核巨噬细胞系统所清除,从而引起外周血血小板减少诱发皮肤黏膜或内脏出血。其发病原因目前仍不清楚,但确认与免疫应答异常有关。实验研究表明,ITP的发病机制与细胞免疫功能异常密切相关。尽管B细胞过度增殖、活化产生针对血小板膜表面糖蛋白(glyeoprotein,Gp)Ⅱb/Ⅲa和GPIb/Ⅸ的自身抗体是ITP发病的直接原因,但T细胞亚群功能缺陷和比例失调导致B细胞被激活可能才是ITP发病的主要机制。目前的研究发现在ITP患者体内,辅助性T细胞(helperTcell,Th)1和Th2处于失衡状态,Th1/Th2比例明显上调,Th17细胞数量增加,调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)细胞的数量减少和功能异常,但导致ITP患者T细胞分化异常的根本原因目前尚不清楚。白细胞介素(interleukin,IL)-12家族细胞因子是具有高度同源性的一类异源二聚体,包括IL-12,IL-23,IL-27和IL-35,它们主要由活化的抗原呈递细胞(antigenpresentingcells,APCs)如巨噬细胞和树突状细胞(dendriticcell,DC)产生。IL-12通过活化STAT4信号转导途径产生干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)促进Thl细胞免疫反应；IL-23通过活化STAT3诱导产生IL-17的Thl7细胞；IL-27促进早期Th1细胞分化并抑制Th2细胞和Th17细胞分化；IL-35可能是潜在的免疫抑制性细胞因子。由此可见,IL-12家族细胞因子对调节Th细胞分化发挥重要的作用,然而到目前为止,ITP患者中IL-12家族细胞因子的表达情况及其在ITP发病中可能发挥的作用仍不清楚。近期研究显示,在慢性ITP治疗过程中,大剂量地塞米松(highdosedexamethasone,HD-DXM)具有良好的治疗效果及很高的安全性,可作为取代强的松(prednisone,Pred)作为治疗ITP的一线治疗方案。研究还发现：HD-DXM可以纠正ITP患者Thl细胞偏极,恢复Thl和Th2细胞因子之间的平衡,显著提高CD4+CD25+Treg及叉头翼状旋转转录因子(forkhead-wingedhelixtranscriptionfactor,FoxP3)的表达。因此,在本研究中,我们比较了在慢性ITP患者和健康对照中血浆中IL-12家族细胞因子及其相关细胞因子的水平,并探讨了其与各临床参数之间的关系。同时还进一步分析了]HD-DXM治疗对IL-12家族细胞因子的影响,以期初步探讨IL-12家族细胞因子在慢性ITP发病机制中的作用。目的：评价IL-12家族细胞因子在慢性ITP发病机制中的作用和HD-DXM冲击治疗对IL-12家族细胞因子表达水平的影响。方法：1.选择慢性ITP患者31例,正常对照来自于36例健康志愿者。2.所有慢性ITP患者口服或静脉滴注DXM40mg/d×4d。3.FlowCytomix技术检测DXM治疗前后血浆中IL-12p70,IL-23,IL-27,IFN-γ,IL-4和IL-17A水平。4.酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测DXM治疗前后血浆中IL-35的水平。结果：1.IID-DXM临床疗效：临床观察经HD-DXM治疗,19例慢性ITP患者达完全缓解,完全缓解率61.29%；6例患者部分缓解,部分缓解率19.35%；6例患者无效,无效率19.35%。治疗过程中未见严重并发症。2.HD-DXM治疗前血浆中细胞因子的水平：和正常对照相比,慢性ITP患者]HD-DXM治疗前血浆中的IL-12p70,IL-23,IL-27,IFN-γ和IL-17A细胞因子水平明显升高(IL-12p70:27.32＋8.19vs14.21±6.23pg/ml,P<0.01；IL-23:789.25±340.52vs477.42±141.65pg/ml,P<0.01；IL-27:60.42±43.68vs32.91±20.37pg/ml,P=0.001；IFN-γ:40.12±19.14vs23.21±10.87pg/ml,P<0.001；IL-17A:29.6±28.08vs9.21±7.9pg/ml,P<0.001).而IL-4和IL-35在慢性ITP患者外周血中显著降低(IL-4:57.69±17.71vs78.7±29.82pg/ml,P=0.001；IL-35:7.82±2.88vs11.89±5.11pg/ml,P<0.01)。3.1HD-DXM治疗后血浆中细胞因子的水平：和HD-DXM治疗前相比,慢性ITP患者HD-DXM治疗后血浆中的IL-12p70,IL-23,IL-27,IFN-γ和IL-17A细胞因子水平明显下降(IL-12p70：16.08±5.48vs27-32±8.19pg/ml,P<0.01；IL-23:517.54±166.67vs789.25±340.52pg/ml,P<0.01；IL-27:32.58±20.21vs60.42±43.68pg/ml,P=0.001；IFN-γ:23.84±11.13vs40.12±19.14pg/ml,P<0.001；IL-17A:11.44±8.48vs29.6±28.08pg/ml,P<0.001)。而IL-4和IL-35细胞因子水平明显上升(IL-4:77.74±20.70vs57.69±17.71pg/ml,P=0.001；IL-35:11.75±6.76vs7.82±2.88pg/ml,P<0.01)。慢性ITP患者HD-DXM治疗后血浆中各种细胞因子水平与正常对照无显著差异(P>0.05)。4.IL-12家族细胞因子与慢性ITP患者外周血血小板计数的相关性分析：为了进一步判定IL-12家族细胞因子与慢性ITP疾病进展的关系,我们分析了IL-12家族细胞因子与慢性ITP患者外周血血小板计数的相关性。结果显示：HD-DXM治疗前后IL-12p70和IL-23与慢性ITP患者外周血血小板计数负相关(治疗前：IL-12p70:r=-0.561,P<0.01；IL-23:r=-0.475,P<0.01；治疗后：IL-12p70:r=-0.489,P<0.01；IL-23:r=-0.570,P<0.01).本研究中我们未能发现IL-27和IL-35与慢性ITP患者外周血血小板计数的相关性。结论；1.1HD-DXM冲击治疗安全有效,可作为慢性ITP一线治疗方案。2.慢性ITP患者血浆中IFN-γ和IL-17A水平明显升高,IL-4水平下降,说明慢性ITP是一种Thl和Th17细胞占优势的疾病,HD-DXM治疗后各种细胞因子水平恢复正常,提示HD-DXM能恢复细胞因子网络之间的平衡。3.慢性ITP患者血浆中IL-12,IL-23和IL-27水平明显升高,IL-35水平减少,HD-DXM治疗后IL-12家族细胞因子水平恢复正常,提示作为一种免疫抑制剂,DXM可能部分是通过调节IL-12家族细胞因子水平控制慢性ITP患者Th细胞之间的平衡。4.IL-12和IL-23的水平在活动期慢性ITP患者外周血血浆中显著降低,HD-DXM治疗后上升并恢复正常,且与外周血血小板计数负相关,提示IL-12和IL-23的水平直接反映了疾病的活动状态。
【作者】李庆生；
【导师】张林杰；
【作者基本信息】安徽医科大学，免疫学，2014，博士
【关键词】免疫性血小板减少性紫癜；白介素-27；T辅助细胞1；T辅助细胞2；T辅助细胞17；白介素-12；细胞因子；地塞米松；

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