枇杷果胶酯酶基因克隆及表达特性分析

【摘要】在植物的授粉受精过程中,花粉管是雄性生殖单位的载体,它携带精细胞并将其传递给卵细胞从而实现精卵结合并完成受精作用,故研究花粉管的萌发和生长调控机制,对研究植物的授粉受精调控机理具有重要的意义。果胶酯酶(Pectinmethylesterase,PME)是一种重要的果胶酶,能催化植物细胞壁上的果胶脱去甲氧基生成果胶酸和甲醇,PME对细胞壁的组成与降解、种子萌发、果实成熟以及花粉发育和花粉管的生长等植物的生长发育过程起重要的作用。目前的研究证实花粉管的生长为顶端极性生长,但是对于其生长过程的分子调控机制尚不很清楚。而花粉管的顶端只含单一果胶质层,故花粉管壁的果胶质代谢和变化在花粉管的顶端生长中起重要的作用。目前,关于PME调控植物花粉的发育和花粉管生长的研究已成为植物生殖生物学研究领域的热点之一。三倍体枇杷在减数分裂、授粉受精及早期胚胎发育过程中均存在异常,造成了大多数三倍体花粉生活力低、萌发率低、花粉管不能完成穿柱到达珠孔、到达珠孔后不能完成融合、融合后合子不能正常发育等现象。因此,深入探讨三倍体枇杷的育性机理,对明确三倍体的无核机理和利用三倍体创制新的种质资源具有重要的意义。为此,本实验在三倍体和二倍体花器官的转录组和表达谱分析的基础上,从中挑选了与花粉管发育相关的差异PME同源基因序列,通过cDNA快速末端扩增(RACE)技术,从枇杷花器官中克隆PME家族基因的全长,并进行基本的生物信息学分析,然后采用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术分析PME家族基因在二倍体枇杷与三倍体枇杷授粉前后的花器官中的表达情况,并进一步的分析它们在花器官中不同部位的表达情况,分析三倍体枇杷育性变化规律,为开展花粉管生长的调控机理研究提供分子生物学依据。本研究取得的主要结果如下：(1)利用RACE技术首次从枇杷中克隆了2条PME基因的全长序列,去掉UPM接头序列,其全长均为2201bp,其中5’端非翻译区为90bp,3’非翻译区为374bp,且其内包含1个完整的开放阅读框(ORF),长度为1737bp,经序列分析,这两个序列有5个位点的碱基存在差异,但其推导的氨基酸序列只有两个位点的氨基酸存在差异,即第226位点和418位点。通过NCBI在线工具BALST比对发现该这两个序列均属于果胶酯酶家族基因。遂将其命名为EjPPME1和EjPPME2。(2)运用生物信息学方法分析了EjPPME1和EjPPME2的同源性,并推导其编码的氨基酸序列,预测了其编码蛋白质的二级结构和三级结构。结果表明EjPPME2的同源性与EjPPMEl一致,二者编码的蛋白与碧桃(Prunuspersica)的一个推定蛋白相似性高达81%,其次与葡萄、草莓的同源性也比较高。此外,它们都含有2个保守结构域,即PMEI结构域和PME结构域。EjPPME1和EjPPME2编码的蛋白的理化性质只有细微的差异,它们的蛋白质二级结构均以α螺旋结构为主,二者均是具疏水性的跨膜蛋白,且定位于分泌通路,即分泌到细胞周质。(3)利用Real-timePCR技术,对EjPPMEl和EjPPME2进行了表达特性分析,发现这两个基因均属于花粉特异表达基因,在2x和3x枇杷中具时空组织表达不一致的特点,在不同发育时期的花器官中,EjPPME1和EjPPME2只在即开期中表达,而在现蕾期和露白期中几乎不表达；在2x枇杷即开期花器官中,其表达量远高于3x即开期花器官,说明EjPPME1和EjPPME2在3x枇杷中表达受到抑制,与前期发现的3x枇杷花粉萌发率低的结果一致。
【作者】唐佳佳；
【导师】梁国鲁；郭启高；
【作者基本信息】西南大学，果树学，2014，硕士
【关键词】枇杷；果胶酯酶；RACE克隆；生物信息学分析；荧光定量分析；

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