猪附红细胞体吉林株单克隆抗体的制备应用和免疫蛋白组学研究

【摘要】附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由寄生于血液内的原核生物——附红细胞体(Eperythrozoon)引起的一类不易引起重视,但具有潜在威胁的新发人兽共患病。该病可导致畜产品质量和产量降低,动物生育力下降,具有流行广泛、隐性感染、慢性迁延和条件致病等特点,严重危害畜牧业发展和人类身心健康。我国是目前猪附红细胞体病流行最为严重的国家之一,几乎所有的省(自治区)均有报道。虽然,国内外对猪附红细胞体病的研究取得了一定进展,但到目前为止对猪附红细胞体病的防治仍无有效措施。因此,本研究克隆了猪附红细胞体吉林株HSPA1基因和α-Eno基因；建立了SYBRGreen荧光定量PCR方法；制备了2株抗猪附红细胞体单克隆抗体,并对单抗的抗体亚型、特异性、细胞定位和中和特性等方面进行了鉴定和分析；应用制备的单抗建立了双抗体夹心ELISA诊断方法；应用感染血清和单抗筛选免疫原性蛋白,并对免疫原性蛋白进行质谱鉴定,.以期为猪附红细胞体病的防制研究奠定基础。1、猪附红细胞体吉林株HSPA1基因和α-Eno基因的克隆和生物信息学分析根据GenBank中猪附红细胞体HSPA1基因和α-Eno基因的DNA序列设计引物,以猪附红细胞体的DNA为模板,进行PCR扩增,将目的基因克隆到pMD-18T-simple载体后,进行序列测定及分析。结果显示,所克隆的HSPA1基因由1044个核苷酸组成,编码333个氨基酸。与GenBank上发表的猪附红细胞体HsPA1基因序列(AM265536)同源性97%,该基因与血巴尔通氏体同源性最近(68.4%)。HSPA1基因编码蛋白等电点为4.69,存在跨膜区。猪附红细胞体α-Eno基因序列编码393个氨基酸,与GenBank上登录的α-Eno序列核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为100%。所克隆的α-Eno基因序列与牛支原体的亲缘关系最近,与犬霉形体亲缘关系最远。本研究旨在从分子角度了解猪附红细胞体吉林株的生物学特性,为猪附红细胞体病的分子诊断和防治提供科学依据。2、猪附红细胞体SYBRGreen荧光定量PCR检测方法建立根据猪附红细胞体α-Eno基因序列,设计了1对特异性引物。利用SYBRGreenⅠ染料进行Real-timePCR反应,建立标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。然后用已建立的SYBRGreen荧光定量PCR方法和常规PCR方法对49份临床样本进行平行检测。结果显示,标准曲线的反应相关系数为0.894,检测极限约为1.44拷贝/μL。特异性分析表明只有猪附红细胞体能检测到特异性的熔解度峰值,而弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合征病毒等DNA样本未检测到特异性的熔解度峰值。组内变异系数、组间变异系数和稳定性系数的CV值均小于5%。临床样本检测结果显示,所建立的荧光定量PCR方法检测的阳性率(40.8%)比常规PCR方法检测的阳性率(30.6%)高10.2%。结果表明,本研究所建立的α-Eno基因实时荧光定量PCR方法灵敏度高,特异性强,稳定性好。该方法的建立将为猪附红细胞体病的诊断和防控提供重要的技术支持。3、抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备和鉴定以纯化的猪附红细胞体裂解抗原免疫6w雌性BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对制备出单抗的抗体亚类和抗体特异性进行鉴定。激光扫描共聚焦技术观察单抗所识别抗原的细胞定位。应用所建立的SYBRGreen荧光定量PCR检测方法,评估单抗对小鼠动物模型体内猪附红细胞体的中和效果。结果显示：试验成功筛选出2株能稳定分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3F7和2C4。诱生小鼠腹水产生的抗体效价可达1：16000和1：14000。抗体亚类鉴定结果显示所获得2株单抗均为IgG2a亚型。Western-blot分析表明,3F7株单抗可识别40ku蛋白抗原,2C4株单抗可识别33ku蛋白抗原。Western-blot鉴定结果表明2株单抗均能特异性地与猪附红细胞体抗原结合,而与弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原均不发生交叉反应。檄光扫描共聚焦显微镜观察表明,所制备单抗可以识别猪附红细胞体抗原蛋白。体内中和试验显示,2株单抗中的3F7株单抗对小鼠动物模型体内人工感染的猪附红细胞体增殖具有一定抑制作用。2株抗猪附红细胞体单抗的成功制备和鉴定,将为猪附红细胞体病的快速检测和防治奠定基础。4、猪附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立和应用为建立方便快捷的猪附红细胞体血清学检测方法,本研究以抗猪附红细胞体单克隆抗体为捕获抗体,兔抗猪附红细胞体多克隆抗体为检测抗体,建立猪附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为：3F7株抗猪附红细胞体单克隆抗体的包被浓度为5.42mg/L兔抗猪附红细胞体多克隆抗体浓度和酶标抗体的稀释倍数分别为6.84mg/L和1：2000,以OD492nm值>0.290作为阳性判定标准。该ELISA方法对弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应；其重复性变异系数小于10%；敏感度可达3.25mg/L。采用建立的ELISA方法与血涂片染色镜检方法同时检测68份临床样品,双抗体夹心ELISA检测的阳性率为29.4%,比血涂片染色镜检方法检测的阳性率高10.3%。本研究建立的猪附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法具有敏感性高、特异性好、成本低及方便快捷等优点,可以用于猪附红细胞体的快速检测。5、猪附红细胞体吉林株免疫蛋白组学研究为了筛选和鉴定猪附红细胞体吉林株免疫原性蛋白。采用二维电泳分析猪附红细胞体蛋白质表达谱,应用感染血清和3F7株单抗与猪附红细胞体2-DE凝胶进行免疫印迹,并对筛选出的猪附红细胞体免疫原性蛋白进行质谱鉴定。结果显示：以上样量为850μg猪附红细胞体蛋白在13cm、pH3～10的IPG胶条上进行电泳,最后用考马斯亮蓝G-250染色,获得了较好的双向电泳图谱。2-DE图谱中共检测到60±5个蛋白质点,蛋白主要集中在pH值6～9和分子量45ku～25ku范围内。猪附红细胞体蛋白质表达谱中的9个蛋白点被猪附红细胞体感染血清和3F7株单抗所识别,5个蛋白质点被成功鉴定,其中2个蛋白质点鉴定为支原体已知蛋白(ATP结合蛋白和胆碱激酶),3个蛋白质点鉴定为由猪附红细胞体基因组序列推测的假定蛋白(假定蛋白Msui05020、假定蛋白Msui06340和假定蛋白CAG：472)。3F7株单抗识别的蛋白经鉴定为ATP结合蛋白。本研究将为进一步开展猪附红细胞体诊断和疫苗候选分子研究奠定基础。结论：1、应用PCR技术,成功克隆了猪附红细胞体吉林株HSPA1基因和α-Eno基因,并对所克隆的目的基因进行了生物信息学分析。2、成功建立了猪附红细胞体SYBRGreen荧光定量PCR检测方法,该方法灵敏性高、特异性强、重复性好。3、成功制备了2株抗猪附红细胞体单克隆抗体,激光扫描共聚焦显微镜观察表明,所制备单抗可以识别猪附红细胞体抗原蛋白。2株单抗中的3F7株单抗对小鼠动物模型体内人工感染的猪附红细胞体增殖具有一定抑制作用。4、应用单抗成功建立了猪附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法,临床应用表明该方法敏感性高、特异性好、成本低廉、方便快捷。5、应用猪附红细胞体感染血清和3F7株单抗成功筛选出了9个猪附红细胞体吉林株免疫原性蛋白,其中5种蛋白被鉴定。
【作者】薛书江；
【导师】张守发；
【作者基本信息】延边大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】猪附红细胞体；荧光定量PCR；单克隆抗体；激光扫描共聚焦；中和试验；双抗体夹心ELISA；免疫蛋白组学；

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