鼠抗人B7-H4单克隆抗体的功能研究及可溶性B7-H4酶联检测试剂盒的优化

【摘要】B7-H4作为一种负性共刺激分子，它是近年来发现的B7家族的新成员之一。它可以通过抑制T细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌来调节适应性免疫反应。人类的B7-H4属于Ⅰ型跨膜蛋白，与其他B7家族成员相比，其胞外部分有20-30％的氨基酸同源性。B7-H4mRNA普遍表达于人的淋巴组织和非淋巴组织，但B7-H4蛋白在正常外周组织中仅微弱表达。而健康者新鲜分离的树突状细胞（DCs）、单核细胞和T、B淋巴细胞均无表达，但在体外经活化刺激因子作用后也呈微弱表达。近年来的研究表明,人的肿瘤细胞如结肠，前列腺细胞以及肺癌和卵巢癌组织等呈现B7-H4的异常表达,提示在肿瘤微环境中，B7-H4在肿瘤细胞逃避机体的免疫监视和维持机体免疫耐受过程中发挥着重要作用。因此，B7-H4有望成为癌症患者的诊断、预后以及治疗的靶标分子之一。本研究旨在通过Jurkat细胞与非小细胞肺癌细胞株SPCA-1共培养的方法，利用本室已制备的鼠抗人B7-H4单克隆抗体5G3去封闭SPCA-1细胞上表达的B7-H4分子，通过共培养，检测共培养后Jurkat细胞的生物学特性的改变。利用本实验室已制备的可溶性B7-H4（sB7-H4）ELISA试剂盒做进一步优化，检测非小细胞肺癌患者血清中sB7-H4分子的表达。一、鼠抗人B7-H4单克隆抗体的功能研究
【作者】张宁；
【导师】顾宗江；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【目的】体外模拟体内环境对共培养后Jurkat细胞的生物学特性进行研究。
【方法】通过RT-PCR和FCM方法检测肺腺癌细胞株SPCA-1上B7-H4表达水平，SPCA-1细胞株与Jurkat细胞共培养72h，收集共培养后的Jurkat细胞，通过FCM方法检测其细胞表面CD3和CD69分子表达变化，Jurkat细胞的凋亡以及用CCK8方法检测其细胞增殖变化。
【结果】SPCA-1表达B7-H4，分子作用于Jurkat细胞，致使Jurkat细胞上CD3、CD69分子表达下调；发生凋亡作用；细胞增殖下降。
【结论】在非小细胞肺癌细胞株SPCA-1中，B7-H4分子能够负性调节T细胞介导的免疫应答，为研究B7-H4分子在肿瘤免疫中的作用提供了理论基础。二、sB7-H4酶联检测试剂盒优化并检测非小细胞患者血清中的sB7-H4含量
【目的】优化人sB7-H4酶联检测试剂盒并检测非小细胞肺癌患者血清中sB7-H4含量。
【方法】以本室已研制的人sB7-H4酶联检测试剂盒为基础，采用鼠抗人单抗1F10作为包埋抗体，以生物素(biotin)标记的鼠抗人单抗8F10和5G3作为检测抗体，对本室已建立的双抗体夹心sB7-H4酶标检测方法进行优化，并对非小细胞肺癌患者血清中的sB7-H4含量进行检测。
【结果】成功优化了人sB7-H4酶联检测试剂盒，检测抗体以0.4μg/ml的8F10和0.1μg/ml的5G3的组合灵敏度最高，检测下线可达0.25ng/ml。用该优化后的试剂盒检测的非小细胞肺癌患者血清中sB7-H4(10.53±2.96)μg/ml，高于健康者(9.0882.43)μg/ml(p<0.05)；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期sB7-H4水平为(10.803.45)μg/ml，明显高于Ⅰ/Ⅱ期(10.33±2.67)μg/ml(p<0.05)；男性和女性sB7-H4水平相差不大(p>0.05)，分别为(10.612.61)μg/ml和（10.38±2.48）μg/ml；年龄大于50岁和小于等于50岁的sB7-H4水平无显著差异(p>0.05)，分别为(10.262.54)μg/ml、(10.412.65)μg/ml；术前sB7-H4平(10.752.72)μg/ml明显高于术后(9.932.88)μg/ml(p<0.05)。
【结论】成功优化了人sB7-H4酶联检测试剂盒,用该试剂盒检测肺癌患者血清中sB7-H4，其含量高于健康者；且与临床分期、治疗情况有关，与年龄和性别无关，sB7-H4有望用于肺癌患者的辅助诊断。综上所述，成功研究了Jurkat与SPCA-1细胞共培养后Jurkat细胞生物学特性变化，优化人sB7-H4酶联检测试剂盒并检测肺癌患者血清中的含量，为进一步研究B7-H4分子临床上的应用奠定了物质基础。
【关键词】B7-H4；Jurkat细胞；SPCA-1；sB7-H4；ELISA；

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