ERS在腺苷诱导的心肌保护中的作用及其机制

ERS在腺苷诱导的心肌保护中的作用及其机制

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-31 分类:文献综述 喜欢:4092
师大云端图书馆

【摘要】随着溶栓疗法、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronaryintervention,PCI)、冠状动脉旁路移植术等治疗方法广泛应用于临床,急性心肌梗死的治疗也进入了再灌注时代。但临床治疗发现心肌在较长时间缺血造成损伤后,再次恢复供血不但不减轻或逆转心肌细胞损伤,反而出现细胞损伤加重现象,出现心肌顿抑、心律失常、心肌细胞坏死等再灌注损伤问题。因此,如何减轻再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI),最大限度保护缺血心肌,对于挽救濒死心肌,改善预后具有重要的临床意义。近年来,不同的动物模型实验证实,腺苷及其受体激动剂均具有对缺血/再灌注损伤心肌的保护效应,并且其保护效应可被腺苷受体抑制剂所抑制。腺苷作为机体能量代谢的产物主要源于ATP降解。研究报道心脏短暂缺血后可引起大量ATP降解,导致局部心肌组织腺苷积聚。腺苷可以触发或介导缺血预适应(ischemicpreconditioning),减轻再灌注损伤,在缺血预处理中起着非常重要的作用,腺苷作为内源性活性物质,不仅主导了早期保护机制,而且在延时保护时也发挥了重要作用。腺苷受体目前发现至少有4种,即A1、A2a、A2b和A3受体,其中A2受体可能在后处理心肌保护效应中起着关键的作用。最近的研究表明,些腺苷拟似剂可选择性地通过A2受体发挥心脏保护作用,但其具体作用机制尚未完全阐明。Hausenloy等人提出抗心肌IRI信号通路的最终步骤是抑制粒体膜通透性转移孔(mitochondrial-permeabilitytransitionpore,mPTP)的开放,而具有抑mPTP开放作用的药物,可以减轻心肌IRI,抑制mPTP的开放是许多心脏保护物质抗IR工的共同机制。糖原合成激酶3β(GSK-3β)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸类激酶,在体内具有非常重要的生物学功能。研究证明,GSK-3β是许多心肌保护信号转导通路的共同作用靶点,抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的开放,进而减轻心肌IRI。内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)指细胞内、外环境的改变,导致内质网内未折叠蛋白质的聚集、钙稳态破坏、生理功能紊乱的一种亚细胞器的病理过程。ERS是应激时发生在细胞中的最初反应,可进一步介导线粒体应激和核应激,近年来其在IRI的作用也在很多实验中得到证实。葡萄糖调节蛋白(glucose-regulatedprotein,GRP78、GRP94)作为内质网上的伴侣蛋白,被认为是内质网应激的标志物。Martindale等人通过实验发现,当新生小鼠心肌细胞在体外经缺血再灌注处理后,ERS诱导的未折叠蛋白反应的标志物GRP78和GRP94的表达水平升高,提示缺血再灌注诱导了ERS反应。Zhang等人在体外大鼠心脏缺血再灌注模型上,发现Ghrelin能通过抑制ERS保护IRI导致的心肌损害。然而,腺苷及其受体的心脏保护作用是否通过ERS途径尚不清楚。目的:探讨NECA是否通过减轻ERS使GSK-3β失活,进而阻止mPTP的开放并保护缺血/再灌注心肌。方法:实验一研究对象选用大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株。用800μMH202处理H9c2细胞,造成细胞的氧化应激损伤。荧光染色使用四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamineester,TMRE),应用激光共聚焦显微镜成像技术,以543nm的氩离子激发光采集图像,观察细胞TMRE荧光及给予相应处理后荧光的变化,测定H9c2细胞线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,△Ψm)的改变,以此判断mPTP的开放程度也即线粒体的损伤程度。通过免疫荧光法及Westernblot法,检钡GSK-3β(Ser9)的磷酸化、血管扩张刺激磷蛋白(Vasodilatorstimulatedphosphoprotion,VASP)(Ser239)、GRP94的改变。探讨腺苷A2受体激动剂(5’-N-ethylcarbo-xamidoad-enosine,NECA)是否通过抑制ERS使GSK-3β失活,进而阻止mPTP的开放而发挥其心脏保护作用,探讨NECA使GSK-3β失活的相关信号转导机制。实验二选用雄性Wistar大鼠,体重为250-300g,利用心脏Langendorff灌流装置及结扎冠状动脉的方法,制备大鼠离体心脏灌流模型。将大鼠随机分为3组,对照组(缺血/再灌注(I/R)组)、NECA组(I/R+NECA)、TUDCA(内质网应激抑制剂)组(I/R+TUDCA),分别在灌流液中加入NECA或TUDCA,于再灌注10、30、60、120min时从缺血区采集心脏组织标本。用TTC法测定心肌梗死面积,以确定NECA的心脏保护作用。用Westernblot法检测内质网应激相关分子GRP94的表达及GSK3β的磷酸化程度。用透射电镜观察心脏缺血/再灌注及给药后心肌超微结构的改变。结果:实验一①激光共聚焦显微镜检测结果显示,H9c2细胞经H202(800μM)处理20min后,测得TMRE荧光强度明显降低(36.7±3.7%)。与H2O2对照组相比,使用不同浓度的NECA(0.01μM-10μM)处理细胞,均能够抑制TMRE荧光强度的降低,其中0.1μMNECA效果最为明显(81.0±1.1%),提示NECA制氧化应激引起的mPTP的开放。②Westernblot结果显示,与对照组相比(97.1±1.3%)、(123.8±4.6%),不同浓度的NECA(0.01μM-10μM)均能增加GSK-3β(Ser9)的磷酸化,同时降低GRP94的表达,其中0.1μMNECA效果最为明显(139.4±5.2%)、(55.7±1.5%)‘,提示NECA可以使GSK-3β失活,ERS可能参与了NECA的心肌保护作用。③Westernblot结果显示,NECA(0.1μM)促进GSK-3β(Ser9)磷酸化的作用被PKG抑制齐KT5823(0.1阻断,提示NECA可能通过cGMP-PKG信号通路调节GSK-3β(Ser9)的磷酸化而发挥其心肌保护作用。与对照组相比(102.12.1%)、(101.4±4.2%),NECA(0.1μM)使VASP(Ser239)的磷酸化明显增多(158.2±2.6%),同时使GRP94的表达明显降低(98.7±2.2%),此作用可被KT5823(0.1μM)所抑制(126.2±2.2%)、(119.6±2.1%),表明NECA可能通过ERS和cGMP/PKG信号通路,使GSK-3β失活而发挥其心肌保护作用。④Westernblot结果显示,NECA(0.1μM)促进GSK-3β(Ser9)磷酸化的作用被ERS诱导剂2-DG(20mM)所阻断;与对照组相比(101.6±3.9%)(116.2±3.3%),NECA(0.1μM)使GSK-3β(Ser9)的磷酸化明显增多(159.7±15.0%),同时使GRP94的表达明显降低(60.5±2.6%),此作用可被2-DG(20mM)所抑制(123.5±9.1%)、(101.2±3.4%)。进一步提示NECA可能通过减轻ERS而调节GSK-3β(Ser9)的磷酸化,从而发挥其心肌保护作用。⑤Westernblot结果显示,对照组相比,H2O2处理细胞导致GSK-3β蛋白的磷酸化水平显著降低,同时使GRP94的表达明显增加,而这一作用被NECA(0.1μM)所阻断,表明NECA通过防止氧化应激引起的GSK-3β活化及内质网应激的发生而发挥其心肌保护作用。实验二①与缺血/再灌注组(I/R)(46.8±5.5%)相比,NECA和内质网应激抑制齐TUDCA使心肌梗死面积(26.5±4.9%)(36.0±5.1%)减小,提示ERS参与NECA的心肌保护作用。②Westernblot结果显示,与对照组相比(97.1±1.3%)、(123.8±4.6%),NECA(0.1μM)和TUDCA均能抑制再灌注期GRP94的表达,增加GSK-3β的磷酸化,提示NECA可能通过抑制GSK-3β的活性和ERS的发生而保护心肌。③透射电镜结果表明与对照组相比,NECA和TUDCA减轻了线粒体肿胀,内质网扩张,表明NECA可能通过抑制ERS而阻止mPTP的开放并保护心肌。结论:①NECA可能通过抑制ERS而使GSK-3β失活,进而抑制mPTP的开放并保护缺血再灌注心肌。②cGMP/PKG信号传导通路可能参与GSK-3β的失活。
【作者】邢凤梅;
【导师】李春玉;
【作者基本信息】延边大学,内科学,2014,博士
【关键词】腺苷受体激动剂;线粒体通透性转移孔;内质网应激;糖原合成酶激酶3β;葡萄糖调节蛋白94;

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