椎体软骨终板退变的实验研究

【摘要】第一部分内皮素-1与人腰椎间盘软骨终板退变的相关性研究目的：探讨内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)导致软骨终板发生退变的机制。方法：按改良的Pfirrmann分型确定椎间盘退变程度,选取8例腰椎退行性病变作为研究对象(退变终板),另外8例腰椎爆裂性骨折病例作为对照研究(正常终板)。在进行腰椎融合手术时取出软骨终板,对标本进行大体观察和H&E染色,以及通过免疫组织化学染色和Westernblotting的方法分析ET-1在退变和正常终板中的表达情况。应用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养人退变终板软骨细胞(CECs),采取H&E、甲苯胺蓝及免疫组织化学染色(Ⅱ型胶原和蛋白聚糖)对软骨终板细胞进行鉴定。通过免疫荧光法分析软骨终板细胞ET-1表达情况。肿瘤坏死因子alpha(TNF-α,0-100ng/ml)作用软骨终板细胞,24小时后进行Real-timePCR从mRNA水平和36小时后进行Westernblotting从蛋白水平分析软骨终板细胞的ET-1表达情况。使用不同剂量的ET-1(1-100nM)作用体外培养的软骨终板细胞,36小时后通过ELISA方法分别检测培养细胞的上清液中基质金属蛋白酶-1、13(MMP-1和MMP-13)和组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)含量；以及36小时后通过一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)试剂盒测定细胞上清液中NO含量和NOS活性；72小时后通过AnnexinV-FITC法分析软骨终板细胞凋亡情况。结果：正常软骨终板为透明软骨,终板细胞的形态近似圆形,细胞外基质均匀、有层次感；退变软骨终板呈现纤维化、骨化,并且出现破裂,部分出现细胞核溶解,伴有血管侵犯。免疫组化显示,在退变软骨终板内ET-1表达为强阳性,定位于终板细胞的胞浆内；而正常终板仅为弱阳性。通过Westernblotting分析,ET-1在退变软骨终板内含量明显高于正常终板。成功进行了CECs原代和传代培养,倒置显微镜下观察,原代细胞12-24小时贴壁,48小时后细胞开始增殖,约7天出现细胞集落,约14天铺满培养皿,细胞形态多样,从梭形到多边型不等。H&E染色显示细胞呈多角形,伴有圆形或椭圆形的细胞核；甲苯胺蓝染色可见终板细胞质有蓝色异染出现；免疫组化染色显示人软骨终板细胞特征性表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(定位于细胞质),所以从细胞形态、生长情况及细胞表型类似于关节软骨细胞。细胞免疫荧光染色显示退变软骨终板细胞表达ET-1,绿色荧光显示分泌型颗粒位于细胞质内。无论是Real-timePCR还是Westernblotting结果都显示TNF-α可以促使CECs表达ET-1,呈剂量递增关系。ET-1作用软骨终板细胞后,随着ET-1剂量的增加,细胞上清液中MMP-1和MMP-13水平增高,后者比前者增加明显,而TIMP-1水平呈下降趋势。NO含量也随着ET-1呈剂量递增,同时伴有NOS活性增强。不同剂量的ET-1并没有诱使软骨终板细胞凋亡增加。结论：退变的软骨终板组织内有高含量的ET-1表达。软骨终板细胞表达ET-1,受到前炎症因子TNF-α的调节。ET-1是软骨终板退变过程中重要的炎症介质,它通过促使CECs分泌MMP-1、MMP-13和NO从而导致软骨终板退变。第二部分大鼠尾椎终板下缺血模型的制作目的：探讨经皮穿刺大鼠尾椎椎间盘终板下骨质,注射无水酒精导致椎间盘退变的可能性。方法：选取3月龄SD大鼠40只,其中8只无任何处理获取正常椎间盘组织。设第八尾椎(Co8)为实验组,相对应的椎间盘是Co7/Co8;Co9为对照组,对应的椎间盘是Co8/Co9。在X-ray透视机器辅助下,距离终板2-3mmm处,使用直径0.7mm(#7)的腰椎穿刺针进行椎体局部穿刺至骨髓腔,连接1mL注射器针管加压注入30μl无水酒精破坏终板下的骨质微循环；而Co9注射磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照。术后第1、2、3和4月随机选取8只大鼠,在麻醉状态下行X线摄像观察椎间隙高度变化。退变的椎间盘通过不同的化学染色进行如下观察,苏木精-伊红(H&E)观察椎间盘的细胞形态变化；番红0-固绿染色显示终板软骨的骨化程度；番红0染色观察椎间盘的黏多糖(glycosaminoglycan,GAG)变化情况,以及终板潮线(tidemark)结构的深浅程度；甲苯胺蓝染色主要观察终板软骨基质的异染性。免疫组织化学染色分别检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖,和Sox-9表达情况。结果：与对照组相比,无水酒精注射后第2个月出现椎间盘高度逐渐降低,以到第4个月时为重。X线提示术后第3和4个月时实验组终板处出现骨质硬化伴有增生。HH&E染色显示终板的生长板(growthplate)随着观察时间的延长,结构出现破损,终板软骨细胞退变、甚至消失,终板钙化直至骨化表现；髓核内细胞的性质发生改变,从第1个月到第2个月空泡样细胞逐渐增多,术后第3个月转变为软骨样细胞,第4个月随着髓核的纤维化,残存的细胞转变为纤维软骨样细胞。随着退变的加重,纤维环出现排列紊乱及板层粗糙、以至断裂和纤维化。番红0-固绿染色显示实验侧终板骨化程度逐渐加重,尤以术后第3、4个月时为甚。番红0染色显示,从术后第1个月开始,生长板处波浪状的潮线颜色变浅,随着终板结构的破坏,潮线结构破坏、逐至消失。此外,番红0染色逐渐变浅提示髓核基质中黏多糖的含量逐渐降低。甲苯胺蓝染色代表的终板软骨基质颜色逐渐变浅,表示向骨性终板转化。缺血侧的终板Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性程度逐渐下降；而髓核Ⅱ型胶原阳性染色程度保持不变或有所增强,其中术后第4个月时着色较浅,为弱阳性。除在第3个月呈短暂增高外,聚集蛋白聚糖(aggrecan)免疫组织化学阳性染色程度伴随退变程度的加重逐渐下降。免疫组化染色显示Sox-9蛋白在退变第3个月时有增高表达,其余的时间点与正常椎间盘相比是降低。结论：椎体终板下的骨质微循环血运障碍,导致终板退变引起椎间盘的营养障碍,最终髓核和纤维环也发生退变,此模型适合于椎间盘退变的病因学研究。
【作者】袁维；
【导师】董健；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】内皮素-1；软骨终板；退行性椎间盘病变；软骨终板细胞；肿瘤坏死因子alpha；无水酒精；微循环障碍；终板；髓核；纤维环；

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