Tirapazamine与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂在人肝癌中合用的药效学及机制研究

【摘要】研究目的：肝细胞癌(HCC)是全球癌症中致死率较高的一种恶性肿瘤,在中国HCC的发病率呈逐年递增的趋势。目前临床上用于治疗肝癌的药物主要有索拉菲尼、舒尼替尼、贝伐单抗、西罗莫司等,但这些药物单独治疗晚期肝癌的效果依然十分有限,新的药物治疗策略亟待开发。拓扑异构酶Ⅰ抑制剂是一类临床具有广谱抗肿瘤作用的药物,在体外具有非常强的抗肝癌活性,但其在肝癌临床治疗中疗效有限。目前对引起体内外之间巨大差异的机制还尚不清楚。肝癌微环境中氧压较其他实体瘤更低,本研究结果表明低氧环境下HIF-1α的高表达是引起人肝癌对拓扑异构酶Ⅰ抑制剂敏感性降低的重要因素之一。Tirapazamine(TPZ)是一种低氧选择性药物,课题组前期实验成果发现其在低氧下可抑制HIF-1α蛋白的合成。本文将研究TPZ和拓扑异构酶Ⅰ抑制剂合用在体内外人肝癌中的抗肿瘤活性,并探讨其合用的具体机制。研究方法：(1)SRB法检测在5种不同的人肝癌细胞株和1种正常的人肝细胞中TPZ和四种拓扑异构酶Ⅰ抑制剂(SN-38、TPT、HCPT、MONCPT)联合用药抑制人肿瘤细胞增殖的能力,并计算了合用指数(CI)。(2)利用shRNA技术沉默HIF-1α基因表达。(3)WesternBlotting法检测体内外相关蛋白的表达情况。(4)双荧光素酶报告基因技术检测HIF-1α转录因子的转录活性。(5)克隆形成实验检测TPZ和四种拓扑异构酶Ⅰ抑制剂联合用药的抗肝癌活性。(6)建立人源性肿瘤裸小鼠Bel-7402移植瘤模型,检测TPZ和CPT-11(SN-38前药)合用对裸小鼠移植瘤的实验治疗作用。(7)DAPI染色法检测给药前后人肝癌细胞中凋亡小体的产生情况。(8)PI单染或Annexin-V/PI双染结合流式细胞术来检测细胞凋亡的发生。(9)利用JC-1染色法检测线粒体膜电位的变化情况。(10)免疫荧光法检测蛋白在细胞或组织内的分布和表达情况。(11)荧光实时定量PCR法检测mRNA的表达。(12)免疫组化法检测瘤组织切片中蛋白的分布及表达情况。(13)利用质粒转染技术扩增细胞内HIF-1α蛋白的表达。研究结果：(1)Tirapazamine与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂在人肝癌中合用的药效学研究：实验结果发现在人肝癌中存在拓扑异构酶Ⅰ抑制剂低氧敏感性降低的现象,而HIF-1α在其中起了关键的作用。TPZ在人肝癌细胞中也可抑制低氧下HIF-1α蛋白的累积。在多株人肝癌细胞中(HepG-2、Bel-7402、Hep3B、Huh7和SMMC-7721)TPZ与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂都可协同抑制肿瘤细胞的增殖,合用指数均在0.7以下。而在正常的人肝细胞中,两者合用并未产生协同作用。同时,TPZ与CPT-11合用在人肝癌Bel-7402移植瘤裸小鼠模型上也表现出显著的协同实验治疗作用,且未引起动物体重显著下降。(2)Tirapazamine与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂在人肝癌中发挥协同作用的机制研究：在人肝癌中TPZ与SN-38(CPT-11的主要活性代谢产物)合用可协同诱导细胞产生凋亡,两者通过降低线粒体的膜电位,激活Caspase-3的裂解,引起PARP的切割,最终诱导人肝癌Bel-7402细胞发生凋亡。TPZ与SN-38合用能够协同降低HIF-1α蛋白的合成速率,抑制HIF-1α蛋白的表达水平和转录活性。而HIF-1α表达水平的下调会导致DNA损伤修复水平的降低,引起细胞内DNA损伤的大量累积。RAD51、Chk1磷酸化水平的降低提示RAD51介导的同源重组修复通路在这过程中扮演了重要的角色。结论：(1)HIF-1α是介导拓扑异构酶Ⅰ抑制剂在人肝癌中低氧敏感性降低的关键因素。TPZ与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂合用可诱导肝癌细胞发生凋亡,抑制体内外肿瘤的增殖,发挥协同抗肿瘤作用。(2)在TPZ与SN-38合用过程中HIF-1α蛋白的降低是关键因素,其产生协同作用的机制是：通过协同抑制HIF-1α的蛋白合成途径,引起HIF-1α蛋白表达和转录活性的下调,抑制了Rad51介导的同源重组修复通路,导致药物引起的DNA损伤在细胞内大量累积,最终诱导细胞走向凋亡。
【作者】蔡天宇；
【导师】杨波；何俏军；
【作者基本信息】浙江大学，药理学，2014，博士
【关键词】TPZ；拓扑异构酶Ⅰ抑制剂；药物合用；低氧；肝癌；HIF-1α；同源重组修复；

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